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本论文以毒剧类中药附子为研究对象,建立HPLC-MS/MS法同时测定附子中与心脏毒性和强心活性有关的生物碱成分含量。针对其心脏毒性,建立了基于大鼠室性早搏的心脏毒性效价检测方法,并测定了生附片及其不同炮制品的毒性效价(致心律失常的最小中毒量),发现蒸附片炮制品和无胆炮制品的减毒效果相对较好。针对附子的强心作用,优化建立了大鼠急性心衰模型的强心活性检测方法,并对比测定了生附片及其不同炮制品,发现无胆炮制品的强心活性高于传统的胆巴炮制品;进一步检测附子中脂溶性生物碱和水溶性生物碱)单体化合物的强心活性,提示水溶性生物碱是附子的重要强心活性成分。研究结果为阐明附子炮制减毒、存效的科学机制提供了实验依据,也为针对性建立附子炮制减毒存效的质量控制标准提供了参考。第一部分HPLC-MS-MS同时测定附子药材与饮片中10生物碱成分的含量目的:为了比较了与心脏毒性和强心活性相关的成分在检测附子中水溶性和脂溶性共10种生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱与印乌头碱4种双酯型剧毒成分,苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱与乌头原碱4种镇痛、抗炎活性成分以及去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱2种水溶性生物碱)在不同产地泥附子、不同等级泥附子以及附子的不同炮制品中的含量差异。方法:建立了HPLC-MS-MS法同时测定乌头碱、新乌头碱、次乌头碱与3种,苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱单酯型生物碱成分、去甲乌药碱、去甲猪毛菜碱2种水溶性生物碱含量、乌头原碱和印乌头碱的含量。结果:附子原生药材中含有极少量的去甲乌药碱与去甲猪毛菜碱。经炮制加工处理后,水溶性的生物碱成分去甲乌药碱大量流失,在刨附片、炮附子、炮天雄、白附片极其痕量,未达到定量限,有的仅是噪音水平。黑顺片中能检测出0.07μg/g的去甲乌药碱,而无胆炮制饮片中的含量明显要高于黑顺片。对于另一种水溶性生物碱去甲猪毛菜碱而言,其含量较去甲乌药碱高,在各种饮片中也能达到定量要求。去甲猪毛菜碱在无胆炮制饮片中的含量约为黑顺片的5倍以上,远高于其他饮片类型。结论:通过本章的化学分析,基本摸清了泥附子与附子炮制品的十种生物碱的含量。总体而言,产地与炮制工艺是影响附子生物碱含量的重要因素。从炮制品来看,炮制工艺越简单各种成分的损失越小、生物碱保留量越大。第二部分心率失常毒性检测评价方法及毒性物质辨识目的:检测生附子及不同炮制品附子(黑顺片、白附片、蒸附片、刨附片、炮天雄)对早期心脏中毒反映(室性早搏),进而评价附子各种饮片的毒性强弱。方法:构建基于大鼠室性早搏(Premature Ventricular Contractions,PVC)最小中毒量(minimal toxic dose,MTD)测定的附子炮制品质量生物评价方法,应用该方法检测生附片及其不同炮制品黑顺片、白附片、蒸附片、刨附片、炮天雄致大鼠室性早搏MTD结果:结果表明,生附片炮制后MTD均显著升高(p<0.05),其中黑顺片、蒸附片、刨附片与白附片的MTD分别为生附片的15.76、22.36、19.65与20.97倍;而炮天雄几乎无毒,用该方法检测不出MTD。结论:该方法可以比较好的反映附子及其炮制品的整体心脏毒性。进一步结合附子炮制品的化学成分分析,发现炮制品中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱,以及单酯型生物碱苯甲酰乌头原碱与PVC呈显著相关。此外,可能还存在其它与致心律失常相关的未测成分,值得深入研究。此研究为附子临床早期心脏毒性评价与质量控制提供了整体、综合的方法,可作为化学评价方法的有益补充。为保障附子临床应用的安全性提供了新的方法。第三部分强心活性评价方法及药效物质辨识目的:本章首先对大鼠急性心衰的模型的复制条件进行了研究,建立了稳定、可行的复制方法;其次,对乌头碱等11种附子生物碱的强心效果进行了评价;最后,以西地兰注射剂为阳性药物,以黑顺片为代表,考察了供试品的制备方法,建立了附子强心活性评价方法,为附子强心活性的准确评价提供了重要方法。方法:通过研究造模药物种类、配伍等因素对大鼠心功能的影响,确定急性心衰大鼠的复制方法为“选取正常+dp/dtmax在6000以上的250±20g雄性大鼠,盐酸普罗帕酮与尼莫酮等比例混合造模,以10ml/h的速度经颈外静脉恒速注射约1.0-1.3 ml造模液,使其+dp/dtmax下降50%以上,即成功复制急性心衰模型”,进一步评价附子中进一步考察11种附子生物碱及9种饮片的强心活性。结果:结果发现,乌头碱及其水解产物并非附子强心活性物质,尼奥林、附子灵、宋果灵及塔拉乌头胺也不具备强心活性;附子不同炮制品强心活性有一定差异,发现无胆炮制品的强心活性高于传统的胆巴炮制品,进一步检测附子中脂溶性生物碱和水溶性生物碱单体化合物的强心活性,发现水溶性生物碱具有较好的强心活性。结论:建立了基于急性心衰大鼠强心活性的评价方法,证实了双酯型生物碱及其水解产物、以及众多的酯性生物碱均非附子的强心成分。采用建立的强心活性评价方法,发现黑顺片煎煮3次,每次1h时,强心效果较为理想,延长煎煮时间,强心效果并未明显增加。采用已建立的模型,首次较为系统地对多种附子市售品的强心作用进行了比较。结果发现自制的精标饮片及生附片强心效果最好,其次是白附片、黑顺片、蒸附片、炒附片等,而刨附片、炮天雄、炮附子的强心作用较弱。该方法的建立为直观准确地评价附子强心活性提供了新的技术手段。