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日本看麦娘(Alopecurus japonicus)是麦田恶性杂草之一,广泛分布在长江中下游地区,严重影响小麦的产量和品质。在过去很多年,乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase,ACCase)抑制剂类除草剂精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)一直是小麦田禾本科杂草防除的主要药剂,随着该药剂的长期使用,日本看麦娘对其产生了抗药性。国内已有较多研究表明ACCase氨基酸突变是抗性日本看麦娘对精噁唑禾草灵产生抗性的重要靶标机理,但是否有代谢酶的解毒作用存在未见报道,对于已存在靶标抗性的日本看麦娘种群是否还存在代谢抗性仍不清楚,为了明确主要代谢酶与日本看麦娘抗精噁唑禾草灵的关系,本文以AHFD-1(色氨酸-2027-半胱氨酸)、AHFD-3(天冬氨酸-2078-甘氨酸)、JCJT-1(异亮氨酸-1781-亮氨酸)、JCJT-2(异亮氨酸-1781-亮氨酸)和JZJR-1(异亮氨酸-2041-天冬酰胺)五个明确靶标突变的抗性种群及敏感种群JNXW-1为研究对象,对细胞色素P450氧化酶系和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)两大重要代谢酶家族的含量、活性及基因表达量进行了研究,得到如下的结果与结论。1、日本看麦娘细胞色素P450氧化酶系与抗精噁唑禾草灵关系的研究采用差光度法测定细胞色素P450氧化酶系的组分细胞色素P450和细胞色素b5含量。结果显示,精噁唑禾草灵处理前,AHFD-1、AHFD-3、JCJT-1、JCJT-2和JZJR-1抗性种群 P450 含量分别为 0.8213、1.4468、1.2200、1.2216和 1.4208nmol·mg-1pro,JNXW-1敏感种群细胞色素P450含量为1.1545 nmol·mg-1pro,药后抗性种群AHFD-3、JCJT-1、JCJT-2和JZJR-1细胞色素P450含量上升,最大值显著(P<0.05)高于敏感种群 1.1926 nmol·mg-1pro,含量分别为 2.2658、1.8916、2.0143 和 1.8975 nmol·mg 1pro。AHFD-1种群药剂处理前显著低于敏感种群,药剂处理后变化不明显。药剂处理前后,敏感种群细胞色素b5含量均高于各抗性种群。采用模式底物分光光度法测定日本看麦娘细胞色素P450氧化酶系介导的对硝基苯甲醚-O-脱甲基酶(PNOD)和NADPH-细胞色素P450还原酶活性。结果表明,精噁唑禾草灵处理前,抗性种群AHFD-1、AHFD-3、JCJT-1和JCJT-2种群细胞色素P450氧化酶系介导的PNOD的活性分别为0.4414、0.3496、0.5293和0.5338 nmol·min-1mg-1pro,敏感种群细胞色素活性为0.5241nmol·min-1mg-1pro;施药后抗性种群 AHFD-3、JCJT-1 和 JCJT-2 活性最大值分别为 0.7238、0.6969 和 0.9595 nmol·min-1mg-1pro,分别升高2.07、1.32和1.82倍,AHFD-1种群药剂处理前后无显著性变化,而JNXW-1敏感日本看麦娘PNOD的活性逐渐下降,7d时下降到0.2746 nmol·min-1mg-1pro。施药前抗性种群 AHFD-1、AHFD-3、JCJT-1 和 JCJT-2 种群中NADPH-细胞色素P450还原酶活性分别为0.0447、0.0588、0.0601和0.0975 nmol·min-1mg-1pro,敏感种群活性为0.0551nmol·min-1mg-1pro;施药后抗性种群AHFD-3、JCJT-1和JCJT-2中该酶的活性显著(P<0.05)高于敏感种群(0.0734),分别为0.1061、0.0941和0.1475 nmol·min-1mg-1pro,而AHFD-1种群活性与敏感种群无显著性差异。采用整株生测法对日本看麦娘细胞色素P450氧化酶系抑制剂的作用进行了测定,所用抑制剂为胡椒基丁醚(PBO)和1-氨基苯并三唑(ABT)。结果表明:细胞色素P450氧化酶系抑制剂PBO和ABT可提高精噁唑禾草灵对抗性种群AHFD-3、JCJT-1、JCJT-2和JZJR-1种群的抑制效果。其中施用ABT和精噁唑禾草灵后,AHFD-3和JCJT-2种群ED50下降最为明显,分别由320.25和336.00 g a.i.·ha-1下降到194.25和147.00 g a.i..ha-1。抑制剂PBO和ABT无法提高精噁唑禾草灵对AHFD-1种群的抑制效果。依据植物P450的保守区(motif),设计简并引物克隆出10条基因,分别属于不同的P450家族,将其进行命名编号Alo-1～10。对其进行表达量实验,结果表明药剂处理后,AHFD-3和JCJT-2两个种群的Alo-2、Alo-3和Alo-9三个基因表达量上调,是敏感种群的2倍以上;JCJT-1种群的Alo-2和Alo-3两个基因表达量上调,是敏感种群的2倍以上;JZJR-1种群的Alo-3基因表达量比敏感种群高2倍以上;AHFD-1种群上调基因的表达量中均未高于敏感种群2倍以上。2、日本看麦娘谷胱甘肽-S-转移酶与抗精噁唑禾草灵关系的研究对谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GST)进行研究,明确GST是否在日本看麦娘对精噁唑禾草灵抗性中起作用。采用模式底物分光光度法测定药剂处理前后抗精噁唑禾草灵日本看麦娘GST活性的动态变化。结果表明:精噁唑禾草灵处理后,GST活性总体先上升,后下降,且抗性种群GST活性并不显著高于敏感种群。依据大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)、菵草(Beckmannia.syzigachne)及小麦的GST基因,设计引物,克隆出3条GST家族基因,对三条基因进行表达量分析。结果表明:药剂处理前后,抗性与敏感种群GST基因均无显著差异。综上所述,在5个已经产生靶标抗性的种群中,AHFD-3、JCJT-1、JCJT-2和JZJR-1这4个种群存在代谢抗性。其中AHFD-3、JCJT-1和JCJT-2种群涉及的代谢抗性与细胞色素P450含量、细胞色素P450介导的PNOD和NADPH-P450还原酶活性及细胞色素P450基因表达量有关,JZJR-1种群涉及的代谢抗性与细胞色素P450含量及细胞色素P450基因表达量有关。AHFD-3、JCJT-1、JCJT-2和JZJR-1种群涉及的代谢抗性与GST无关。AHFD-1种群不涉及细胞色素P450氧化酶系和GST方面的代谢抗性。