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研究背景及目的:特发性肺纤维化（IPF）病理早期表现为肺泡炎,晚期成纤维细胞转化为表达平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）的肌成纤维细胞,细胞外基质（ECM）过度沉积。减少肺间质内ECM沉积,促进其降解是IPF治疗的关键环节。降解细胞外基质的两种主要酶类是纤溶酶和基质金属蛋白酶（MMP）。纤溶酶原激活物抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）通过灭活尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）及组织型纤溶酶原激活物（tPA）,抑制纤溶酶形成和MMP活性,促进ECM沉积和肺纤维化的发展。近年研究表明,PAI-1可能作为独立因素促进器官纤维化的发生、发展,如:过表达PAI-1可能加重正常皮肤和瘢痕皮肤成纤维细胞胶原沉积;PAI-1-/-的小鼠博莱霉素诱导的肺纤维化程度减轻。因此,我们设想通过下调肺纤维化过程中PAI-1的表达达到治疗肺纤维化的目的,并初步探讨其发挥作用的信号途径。RNAi的发现是生物界的一场革命,siRNA技术是以转录后调节为目的的新型基因调控技术,通过合成特异性小分子RNA抑制靶基因的表达,已作为基因功能研究和基因治疗的全新手段。本研究中,我们首先在体外观察上调或下调PAI-1表达对成纤维细胞增殖的影响,然后应用PAI-1 siRNA治疗博来霉素诱导的肺纤维化,以期为临床肺纤维化的治疗提供新的分子靶点。方法:1建立大鼠成纤维细胞低表达及过表达PAI-1的细胞模型1.1体外分离培养原代大鼠胚肺成纤维细胞,免疫组化法检测波形蛋白及α-SMA进行鉴定。1.2筛选PAI-1 siRNA有效序列参考文献,合成针对PAI-1 mRNA的3对siRNA序列,分别为219siRNA片段,559siRNA片段和1061siRNA片段。应用脂质体法瞬时转染成纤维细胞,以非特异性（NC）siRNA为阴性对照,采用Real timeRT-PCR及Western blot法从基因水平及蛋白水平分别检测三对siRNA分子的沉默效率,筛选出针对PAI-1 mRNA高效的siRNA片段。1.3为了应用含PAI-1基因的真核表达质粒PCDNA-PAI-1转染成纤维细胞,载体PCDNA3.1作为阴性对照,Real time RT-PCR法观察24小时PAI-1 mRNA的表达,Western blot法观察48、72小时PAI-1蛋白的表达。2 PAI-1对成纤维细胞增殖、转化、胶原合成、Ca2+浓度的影响及其机制细胞分为Normal组、NC组、559 siRNA组、PCDNA3.1组、PCDNA-PAI-1组,MTT法检测细胞24小时, 48小时,72小时增殖效果;激光共聚焦显微镜观察48、72小时细胞内游离Ca2+浓度的变化;细胞分为Normal组、NC组、559 siRNA组以及Normal组、PCDNA3.1组、PCDNA-PAI-1组,Real time RT-PCR法分别测定24小时α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达;Western blot法分别测定48、72小时ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达。3 559 siRNA对BLM诱导大鼠肺纤维化的治疗作用及其信号通路130-140克Wistar健康雄性大鼠72只,分成4组,Sham组、BLM（B）组、BLM+559 siRNA组（B+P组）和BLM+非特异（NC）siRNA组（B+N组）。首先按5mg/kg气管内注入BLM制作肺纤维化模型,Sham组注入0.2 mL生理盐水。造模后,每周两次气管内给药:B+P组注入DEPC水溶解的559 siRNA7.5nmol（0.2mL）;B+N组注入相同剂量的NC siRNA;Sham组和B组注入0.2ml生理盐水。于第7、14、28天各组分别处死6只:Real time RT-PCR及Western blot法测定每个时间点PAI-1基因水平及蛋白水平的敲除效率;观察治疗后组织学（HE染色）变化;Real time RT-PCR、Western blot及免疫组化法测定α-SMA表达的变化;通过Masson染色及羟脯氨酸含量的测定观察559 siRNA对胶原产生的影响,Real time RT-PCR及免疫组化法进一步分析Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达,了解559 siRNA对不同胶原类型的影响;Western blot法测定不同时间点ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达,了解559 siRNA发挥作用的信号通路。4统计学处理采用SAS8.0软件进行统计学分析,计量资料以（X|-）±S表示。观察组与对照组的样本均数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1成功建立低表达及过表达PAI-1的细胞模型1.1免疫组化法检测到培养细胞波形蛋白表达阳性,α-SMA表达阴性,鉴定为成纤维细胞,选取2-4代细胞进行试验。1.2分子生物学方法筛选出siRNA有效序列转染559 siRNA 24小时后,Real time RT-PCR结果显示,PAI-1 mRNA表达下调70±7%,Western blot结果显示,48、72小时PAI-1蛋白表达分别下调73.5±10%、42±3%;转染219 siRNA后,PAI-1 mRNA下调25±13%,蛋白表达分别下调47±20%、29.3±1%。1061 siRNA对PAI-1基因及蛋白表达均无影响。我们认为,559 siRNA对PAI-1表达有较好的抑制效果。1.3成功建立过表达PAI-1 72小时以上的成纤维细胞PCDNA-PAI-1转染成纤维细胞后,Real time RT-PCR法24小时PAI-1 mRNA表达上调1818±6.10 %（P<0.01）,48、72小时蛋白表达分别上调280.6±49%、306.6±32.4%（P<0.01）。2过表达或阻断PAI-1表达对成纤维细胞增殖、转化、胶原合成及Ca2+浓度的影响及其机制2.1 MTT结果显示,转染559 siRNA后,细胞增殖明显低于NC组（P<0.01）,以48小时作用最明显,72小时作用有所减弱。转染PCDNA-PAI-1后,细胞增殖率明显增加,作用可持续72小时（P<0.01）。2.2共聚焦显微镜观察正常培养的大鼠胚肺成纤维细胞内有一定浓度的Ca2+,转染559 siRNA后,Ca2+浓度下降,转染PCDNA-PAI-1后,Ca2+浓度持续上升,与对照组比较均有明显统计学差异（P<0.05）。2.3 Real time RT- PCR结果显示:阻断或过表达PAI-1表达,成纤维细胞中α-SMA及Ⅰ型胶原的mRNA表达水平明显减低或增加（P<0.05）;而改变PAI-1表达对Ⅲ型胶原的mRNA无影响（P>0.05）。2.4 Western blot结果显示,改变PAI-1表达,对非磷酸化状态的AKT、ERK信号途径没有影响,而阻断或过表达PAI-1,可以明显下调或上调p-AKT、p-ERK的水平（P<0.01）,PAI-1可能是通过活化AKT、ERK信号途径发挥促进成纤维细胞增殖、转化的作用。3 559 siRNA对肺纤维化的治疗作用3.1 559 siRNA在动物水平的敲除效率气管内滴入559 siRNA后,7天、14天、28天PAI-1 mRNA水平分别下调29±9%、58±9%、67±7%,蛋白表达分别下调46±11%、51.9±5.3%、65.5±4%。通过免疫组化观察到,治疗后各时间点成纤维细胞胞浆中PAI-1表达明显减少（P<0.01）,我们认为,559 siRNA可以成功下调肺组织PAI-1的表达。3.2组织学变化HE染色观察到B组、B+N组第7天肺泡腔及间质内可见大量炎性细胞浸润,随着时间延长,肺泡间隔明显增厚。B+P组各时间点肺泡炎及肺泡结构破坏明显减轻。3.3 559 siRNA对肺组织成纤维细胞转化的影响Real time RT-PCR及Western blot结果显示,7天、14天、28天B+P组肺组织α-SMA mRNA及蛋白表达均明显下调,与B+N组有明显统计学差异（P<0.01）,免疫组化结果显示,治疗后肺组织α-SMA在胞膜及胞浆中的表达明显减少。3.4 559 siRNA对肺组织胶原表达的影响3.4.1 Masson染色观察到模型组7天时无明显胶原产生,14天有小灶性胶原形成;28天间质内可见大量胶原纤维呈束状或片状沉积,形成明显纤维化。通过图像分析积分光密度总和得出,B+P组在14天及28天纤维化明显减轻,（P<0.05）。3.4.2肺组织匀浆中羟脯氨酸含量的测定肺组织匀浆中,7天时羟脯氨酸的含量不升高,从14天开始到28天各组羟脯氨酸的含量持续升高,B+P组羟脯氨酸含量与B+N组比较明显减低（P<0.01）。3.4.3 559 siRNA对Ⅰ型胶原表达的影响559 siRNA对Ⅰ型胶原mRNA的抑制作用主要表现在7天、14天,28天抑制作用减弱。免疫组化显示治疗后各时间点Ⅰ型胶原在成纤维细胞和肺间质内表达明显减低,与NC组比较均有明显统计学差异（P<0.01）3.4.4 559 siRNA对Ⅲ型胶原表达的影响Real time RT-PCR及免疫组化结果显示559 siRNA对Ⅲ型胶原的抑制作用主要表现在病理过程的晚期,7天时抑制作用不明显,随着肺纤维化的加重,14、28天与B+N组有明显统计学差异（P<0.01）。3.4.5 Western blot测定ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达:结果显示,治疗7天、14天、28天后,p-AKT、p-ERK的表达明显下调,与B+N组有明显统计学差异（P<0.05）,而ERK、AKT表达没有变化,与细胞试验结果一致。结论:1从体外试验得出,559 siRNA及PCDNA-PAI-1可以成功高效转染进入原代大鼠胚肺成纤维细胞,从而使PAI-1表达下调或上调72小时以上;下调PAI-1表达可以抑制成纤维细胞转化、增殖、胶原合成,降低细胞内Ca2+浓度,使磷酸化AKT、ERK表达下调;上调PAI-1表达可以促进成纤维细胞转化、增殖、胶原合成,增加Ca2+浓度,活化AKT、ERK信号途径。2从动物试验得出,在肺纤维化过程中,PAI-1表达上调,PAI-1559 siRNA可以下调其表达;559 siRNA可以减少肺组织胶原的合成、促进ECM降解,阻滞肺纤维化的发展;559 siRNA下调PAI-1表达后,可能通过下调肺组织成纤维细胞内磷酸化ERK、AKT的表达水平发挥治疗肺纤维化的作用。