论文部分内容阅读
研究意义目前,结核病(Tuberculosis,TB)仍然是世界范围内的一个重大公共卫生问题。TB是全球死亡人数最多的传染病,其病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)细胞壁厚、通透性差,并且它主要寄生在巨噬细胞(Mф)内,导致药物难以渗透MTB的双重障碍而耐药,TB的控制依然面临严峻挑战,临床上迫切需要寻找新的抗结核感染治疗新方法,为此,本文研究了LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)的生物学效应和杀菌机制,有望为结核病的治疗提供一种无创、安全、有效的方法。目的探讨LFLIU联合载药PLGA纳米粒突破Mф、MTB细胞壁双层屏障的杀菌效果及机制,有望显著缩短结核病化疗疗程,为陷入困境的结核病治疗带来新突破。方法1.LFLIU对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的损伤效应:选用频率为42KHz,换能器直径45mm,输出声强范围0.13~0.34 W/cm~2连续可调的超声波发射仪。分别用声强0.14 W/cm~2、0.33 W/cm~2的超声辐照巨噬细胞RAW264.7 0、5、10 min和15 min,筛选出对巨噬细胞活性无明显影响的超声辐照剂量。(1)建立耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞吞噬模型,用声强0.14 W/cm~2的超声分别辐照该感染细胞0、5、10 min。(2)选用正常RAW264.7细胞,用声强0.14 W/cm~2的超声分别辐照0、5、10 min。实验后,分别采用流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率和坏死率,使用平板计数法评估RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的活性,使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察并定量RAW264.7细胞经超声辐照后产生的活性氧。2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞RAW264.7内耻垢分枝杆菌的杀菌作用和机制:(1)采用双乳化法制备载左氧氟沙星PLGA纳米粒,利用马尔文激光粒度仪检测该纳米粒的粒径,电位和多分散性;在电镜下观察它的形态和内部结构;测量载药纳米粒72h内药物自然释放率及一定超声辐照后药物的释放率;比较游离左氧氟沙星和载左氧氟沙星纳米粒分别对RAW264.7细胞的毒性作用。(2)将被感染耻垢分枝杆菌的巨噬细胞分为6个组(N=3):对照组、游离左氧氟沙星组、载左氧氟沙星纳米粒组、单独超声辐照组、超声联合游离左氧氟沙星组、超声联合载左氧氟沙星纳米粒组。实验后,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察和检测LFLIU对载左氧氟沙星纳米粒的吞噬情况以及细胞内产生的活性氧,同时用流式细胞仪分析被处理后的RAW264.7细胞的坏死率和凋亡率,用透射电镜观察巨噬细胞和细胞内耻垢分枝杆菌的结构变化,通过菌落计数法评估RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的存活情况。结果1.成功制备了物理特性好的载左氧氟沙星PLGA纳米粒:(1)扫描电镜下观察呈球形,形态均一、分散性良好,透射电镜下可见药物被包封于PLGA纳米粒内部。(2)纳米粒性能稳定,Zata电位为-20.8±4.25mV,粒径较小,仅为229.8±?12.1nm,载药率和包封率分别是(8.36?±?0.74)%、(84.74?±?1.28)%。(3)连续监测了72h内载药纳米粒内药物的释放,72h后,超声处理组约有74%的左氧氟沙星被释放出来,对于未经超声处理的自然释放组,大约只有39%的药物被释放,结果表明超声可诱导纳米粒内左氧氟沙星的释放。(4)PLGA纳米粒内药物浓度在一定范围内时,对巨噬细胞无细胞毒性。2.一定剂量的LFLIU对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的损伤效果显著:用不同声强和时间辐照巨噬细胞及吞噬模型,结果提示:(1)用声强0.33 W/cm~2的LILIU辐照巨噬细胞5、10、15min以及用声强0.14W/cm~2的LFLIU辐照巨噬细胞15 min时,巨噬细胞的存活率低于75%,影响巨噬细胞的活性,当超声强度为0.14 W/cm~2,辐照时间为5、10 min时,对巨噬细胞的生长活性影响较小,此时巨噬细胞存活率分别为(116.37±9.54)%,(97.14±9.26)%。(2)用声强0.14 W/cm~2的超声辐照RAW264.7细胞10 min时,耻垢分枝杆菌的吞噬率达到了58.55%,而假照组吞噬率为32.47%,表明LFLIU可以促进巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的吞噬。(3)当RAW264.7细胞感染耻垢分枝杆菌后,用声强0.14W/cm~2的LFLIU辐照5 min,细胞凋亡率和坏死率高于超声辐照0 min(P<0.01),但LFLIU辐照10min时,细胞凋亡率和坏死率未进一步增加。(4)用声强0.14 W/cm~2的LFLIU辐照10 min时,RAW264.7细胞内活性氧浓度高于超声辐照5 min(P<0.01),结果提示随着LFLIU辐照时间的增加,细胞内活性氧浓度增加。(5)用声强0.14 W/cm~2的LFLIU辐照0、5、10min后,RAW264.7细胞内的耻垢分枝杆菌活菌数分别为(4.64±0.21)×10~5 CFU/mL,(3.73±0.21)×10~5,(2.20±0.21)×10~5 CFU/mL,表明RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌菌活力随着LFLIU辐照时间的增加而降低,最佳LFLIU辐照剂量为声强0.14 W/cm~2,辐照时间10min。3.LFLIU协同载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的杀菌效果显著:(1)声强0.14 W/cm~2LFLIU处理10min后,巨噬细胞对纳米粒的吞噬率为54.86±7.45%,假照组的吞噬率为33.18±4.16%,差异有统计学意义(P<0.01),表明LFLIU能促进巨噬细胞对纳米粒的吞噬。(2)LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒可显著诱导细胞内活性氧的产生,超声联合载药纳米粒,活性氧荧光强度达到了1844.3±46.7,约为对照组(993.9±47.5)的两倍。(3)与对照组相比,超声联合载药纳米粒的凋亡率为(21.25±1.15)%,差异有统计学差异(P<0.01),提示超声联合载左氧氟沙星纳米粒促进巨噬细胞的凋亡。(4)一定剂量的LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒可对RAW264.7细胞自身产生损伤效应,透射电镜下观察到超声处理后,巨噬细胞部分微绒毛消失,细胞核体积减小、染色质浓缩,巨噬细胞内耻垢分枝杆菌受到严重损伤,耻垢分枝杆菌壁破裂,结构不完整,脂滴和糖原含量增加。(5)LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌的杀菌率为82.2%,显示出高于对照组(不用药物处理,也不用超声处理)10倍的抗菌活性。结论1.一定剂量的LFLIU可促进RAW264.7细胞对耻垢分枝杆菌的吞噬作用,单独超声可损伤巨噬细胞内耻垢分枝杆菌。2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的增效杀菌作用显著。