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研究背景自然杀伤(natural killer ,NK)细胞是机体天然免疫系统的主要细胞成分之一,在抗病毒、抗肿瘤和移植排斥反应中起着十分重要的作用。自然杀伤细胞受体G2D(natural killer cells receptor group 2D,NKG2D)是NK细胞表面的一种活化性受体,可激活NK细胞对靶细胞的杀伤效应。NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤机制主要是通过Fas(CD95)和FasL(CD95L)相互作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用( antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)以及通过直接释放细胞毒效应分子穿孔素和颗粒酶B而破坏靶细胞。人类NK细胞的分化抗原很多,其中具有代表性的细胞表型为CD3-、CD56+、CD16+[7,8]。人外周血约80-90%的NK细胞低密度表达CD56(CD56dim),同时高水平表达CD16(CD16brigh),可有效地发挥细胞毒作用;约10-20%的NK细胞表型为CD56brighCD16dim或CD56brighCD16-,其功能主要是分泌细胞因子,参与机体的免疫调节。但在肝癌患者中,外周血NK细胞受体NKG2D和NK细胞亚群分布的变化如何,其对NK细胞杀伤活性的影响又如何,文献报道较少涉及,本研究就此进行探讨。研究目的1.探讨正常人外周血NK细胞亚群的生物学特性。2.探讨原发性肝癌患者外周血NK细胞受体NKG2D表达及NK细胞亚群分布的变化,并分析其对NK细胞杀伤活性的影响。研究方法1.应用流式细胞仪在单个细胞水平上分析正常人外周血NK细胞亚群的多样性和生物学特征。2.应用流式细胞仪检测分析20例原发性肝癌、23例乙型肝炎后肝硬化、20例乙型肝炎及20例健康者的外周血NK细胞数量、其受体NKG2D的表达及NK细胞亚群的分布情况,并用酶标仪检测分析各组样本NK细胞的细胞毒活性。研究结果1.根据CD56和CD16分子表达与否将NK细胞分为CD56+、CD56+CD16+和CD16+三个亚群。在健康人中,CD56+NK细胞表面CD95、NKG2D及细胞内穿孔素+颗粒酶B的表达分别为22.2(18.0,29.0)%、53.4(47.1,62.0)%、53.0(44.7,63.0)%,明显低于CD56+CD16+NK细胞[39.9(35.8,44.9)%、69.1(63.8、76.7)%、95.9(89.5,99.3)%]和CD16+NK细胞[39.1(32.9,46.0)%、67.9(63.1,72.1)%、93.6(85.7,96.3)%],差异有统计学意义,P均<0.01,而CD56+CD16+和CD16+NK细胞亚群之间则无明显差异,P均>0.05。因为NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤机制主要是通过Fas(CD95)和FasL(CD95L)相互作用以及直接释放细胞毒效应分子穿孔素和颗粒酶B而破坏靶细胞,因此该结果说明NK细胞杀伤作用主要通过CD56+CD16+和CD16+NK细胞进行,其杀伤作用较单纯CD56+细胞明显强。(除平均值外,所有结果都是用中位数表示法即M(P25,P75),下同。)2.肝癌和肝硬化组CD56+NK细胞比例分别为16(12,29)%、18(13,25)%,均高于正常组10(8,18)%和乙肝组13(10,15)%(均P<0.05),肝癌和肝硬化组CD56+CD16+NK细胞比例分别为75(62,78)%、70(57,81)%,均低于正常组80(72,85)%和乙肝组79(71,82)%(均P<0.05),而CD16+NK细胞四组间无明显差异[正常组8(3,12)%,乙肝组8(4,11)%,肝硬化组7(5,15)%,肝癌组9(6,12)%],均P>0.05。由于CD56+CD16+和CD16+NK细胞的杀伤作用较单纯CD56+ NK细胞明显强,因此本组结果提示肝癌和肝硬化患者NK细胞的杀伤作用较对照组及乙肝组明显减弱。3.原发性肝癌患者的NK细胞杀伤率、NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞中NKG2D的表达水平及NK细胞数[(25±7)%、6(3,13)%、0.7(0.3,0.9)×107、15(11,30)、(1.1±0.6)×108]均明显低于正常组[(63±7)%、36(28,44)%、8.3(7.0,10.6)×107、116(99,153)、(2.7±1.1)×108]和乙肝组[(41±8)%、16(12,24)%、2.8(2.0,3.7)×107、49(31,72)、(1.9±1.1)×108],差异均有统计学意义(均P<0.05);与肝硬化组[(29±10)%、7(4,15)%、0.6(0.3,1.7)×107、29(16,42)、(1.5±1.2)×108]比较也略低,但只有NK细胞NKG2D的表达水平两组差异有统计学意义(P<0.05),其余指标包括NK细胞杀伤率、NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数及NK细胞数两组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。4.进一步分级比较,肝癌组Child B级和C级NK细胞杀伤率、NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞中NKG2D的表达水平分别为Child B: (27±5) % , 6.1(3.2,11.9)%, 0.7(0.5,0.9)×107, 14(12,23);Child C: (17±2) %, 3.0(1.1,5.6)%, 0.2(0.1,0.3)×107, 6(4,18),均分别较肝硬化组[Child B: (39±9)%, 12.4(8.7,25.6)%, 2.0(1.3,3.0)×107, 39(30,83); Child C: (25±6) %, 4.5(2.2,11.0)%, 0.4(0.3,0.7)×107, 20(14,37)]低,其中NK细胞杀伤率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞中NKG2D的表达水平在肝癌Child B与肝硬化Child B、肝癌Child C与肝硬化Child C两组间差异显著,P<0.05,但NK细胞NKG2D的阳性表达率两组间差异无显著性,P>0.05;肝癌组和肝硬化组Child B级NK细胞杀伤率、NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞中NKG2D的表达水平均较Child C级高,其中NK细胞杀伤率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞中NKG2D的表达水平在肝癌Child B与肝癌Child C、肝硬化Child B与肝硬化Child C两组间差异显著,但NK细胞NKG2D的阳性表达率两组间差异无显著性,P>0.05。5.肝癌组Child B级NK细胞数和NK细胞亚群CD56+NK、CD56+CD16+NK、CD16+NK构成比分别为:(1.2±0.6)×108、15.4(11.2,35.5)%、74.3(55.5,77.0)%、9.8(6.4,11.8)%,肝癌组Child C级分别为:(0.8±0.4)×108、16.4(15.3,17.7)%、76.4(70.3,77.9)%、8.5(4.4,13.6)%,肝硬化组Child B级分别为:(1.8±1.5)×108、19.7(12.9,22.5)%、72.1(56.0,80.4)%、13.2(4.2,21.5)%,肝硬化组Child C级分别为:(1.2±0.9)×108、16.7(13.0,30.0)%、70.2(57.6,82.9)%、6.7(4.0,14.1)%,其在肝癌Child B与肝硬化Child B、肝癌Child C与肝硬化Child C、肝癌Child B与肝癌Child C、肝硬化Child B与肝硬化Child C四组间差异无显著性,P均>0.05。6. NK细胞的活性与NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞NKG2D的表达水平、NK细胞数及NK细胞中CD56+CD16+NK比例均呈正相关关系(n=83例)(r=0.770、0.927、0.734、0.657,0.287,均P <0.01),与NK细胞中CD56+细胞比例呈负相关关系(r=-0.301,P<0.01)。肝癌组和肝硬化组Child-pugh积分与NK细胞活性、NK细胞NKG2D的阳性表达率、NKG2D+NK细胞数、NK细胞NKG2D的表达水平及NK细胞数均呈负相关性(肝癌组:r=-0.647,-0.356,-0.652,-0.414,-0.380;P=0.002,0.124,0.002,0.069,0.098;肝硬化组:r=-0.517,-0.368,-0.566,-0.412,-0.311;P=0.012,0.084,0.005,0.051,1.490)。结论1. NK细胞乃异质性群体,随着CD56表达减少和CD16表达增加,其细胞杀伤功能逐渐增强。2.肝癌患者外周血NK细胞活性降低与NKG2D的表达下调和NK细胞亚群分布变化有关。3.肝功能可影响NK细胞NKG2D的表达和NK细胞的杀伤活性,但对NK细胞亚群分布无明显影响。