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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员,系无囊膜病毒,其基因组为单股环状DNA。目前发现4种血清型,分别为PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中,PCV2可引起断奶仔猪发生多系统衰竭综合征,仔猪先天性震颤,怀孕母猪流产,成年猪的皮炎肾病综合征以及呼吸道疾病综合征等,给世界养猪业造成了严重危害。目前,疫苗免疫是防控PCV2的主要手段,现有商品化的PCV2疫苗均为灭活疫苗或亚单位疫苗,所诱导产生抗体不能与野毒感染产生的抗体相区别,难以将猪体内已感染的PCV2彻底清除。因此,研究开发一种既能激发机体产生体液免疫和细胞免疫,又能区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,用以防控PCV2相关疫病的新型疫苗,具有重要意义。本研究利用新建立的Taq Man荧光定量PCR检测方法,对实验室构建的携带有遗传标记的感染性克隆质粒pc DNA3.1(+)-PCV1-2m-V5(PCV1-2m iDNA)免疫小鼠后PCV1-2m病毒血症进行检测,以确定最佳免疫剂量,进而对PCV1-2m iDNA候选标记疫苗免疫昆明小鼠产生免疫效果进行研究,以期为评估PCV1-2m iDNA候选标记疫苗在本体动物(猪)的免疫效果奠定基础。具体研究内容如下:1、PCV1-2m拯救病毒Taq Man荧光定量PCR方法的建立与初步应用为了解PCV1-2m iDNA候选标记疫苗免疫小鼠后拯救获得的PCV1-2m病毒血症载量与诱导抗体之间的关系,以确定最佳免疫剂量和二免时间。本研究根据pc DNA3.1-PCV1-2m-V5质粒的PCV2-ORF2和V5标签序列,设计了一对特异性引物和探针,以该质粒作为阳性标准品,经系列条件优化后,建立了可定量检测PCV1-2m病毒血症载量的Taq Man荧光定量PCR方法。而后,应用该方法对免疫不同质粒浓度的6组小鼠,分别在免疫后1～9W进行病毒血症检测;同时,应用ELISA方法分别对PCV2抗体滴度进行检测。结果表明,实验建立的荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性,检测范围可达1.29×10~1～1.29×10~9拷贝/微升;病毒血症可持续至第5W,抗体可维持至第8W。通过分析抗体滴度变化与病毒载量消长关系,确定使用200μg作为小鼠的最佳免疫剂量。首免后,分别在1～5W不同时间二免,根据特异性抗体产生与病毒血症载量变化情况,确定首免后第4W作为最佳二免时间。2、PCV1-2m iDNA候选标记疫苗诱导小鼠免疫效果的研究为了解PCV1-2m iDNA候选标记疫苗诱导小鼠免疫情况,本研究使用最佳免疫剂量和二免时间,对6～8周龄SPF昆明小鼠分组免疫,首免后1～8W,每周分别断颈采血,无菌采集脾脏备检。使用流式细胞术,测定免疫小鼠外周血细胞中T、B淋巴细胞亚群含量;使用ELISA试剂盒检测Th1型和Th2型细胞因子;使用MTT法检测ConA和LPS刺激小鼠脾淋巴增殖情况。结果显示:与PBS和pc DNA3.1(+)组比较,实验组PCV1-2m iDNA候选标记疫苗免疫后,T、B淋巴细胞亚群中CD4+、CD19~+以及CD4~+/CD8~+比值以及Th1型和Th2型细胞因子极显著提高(P<0.01);ConA和LPS刺激脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞显示,ConA诱导T淋巴细胞效果较LPS刺激B细胞免疫效果好。表明该候选标记疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,且细胞免疫效果更好。为了解该候选标记疫苗的免疫效果与国内外商品化疫苗是否存在差异,以及PCV1-2m拯救病毒的传播方式和安全性,本研究分别比较了国内外四种不同商品化疫苗免疫小鼠后PCV2的抗体滴度、同群饲养和隔离饲养后病毒传播方式,以及免疫一段时间后内脏及注射部位注射质粒的整合情况。结果显示:本研究候选标记疫苗与国内外四种疫苗,免疫后抗体水平无显著性差异(P>0.05),但均与pc DNA3.1(+)、PBS对照组差异极显著(P<0.01);拯救病毒可以通过同群水平接触传播,但不能通过空气进行水平传播;未检测到目的片段整合到小鼠体内,表明本试验候选标记疫苗在基因整合方面对小鼠而言是安全性的。