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背景肢体淋巴水肿是医学界尚未攻克的难题之一,其疗效不佳、容易反复发作,仍缺乏有效的治疗方法。淋巴结移植通过移植自体淋巴结,试图恢复局部淋巴结结构与功能,以达到改善患肢淋巴回流、治疗肢体淋巴水肿的目的。该方法为肢体淋巴水肿的治疗提供了新的思路,被认为是治疗肢体淋巴水肿较有希望的手术方法之一。血管内皮生长因子C (VEGF-C)具有促进胚胎淋巴系统发育、淋巴内皮细胞增生、淋巴管再生等作用,是目前淋巴系统再生方面研究的热点。本实验以腺病毒为载体,将VEGF-C基因转导到大鼠腋窝淋巴结移植模型的淋巴结中,观察其在淋巴管再生中的初步作用,探讨提高淋巴结移植疗效的可行性方法。第一部分大鼠腋窝淋巴结移植模型的建立目的建立大鼠腋窝淋巴结移植模型,并验证该模型进行腋窝淋巴清扫的有效性。方法以偶氮蓝溶液皮下注射的方法使大鼠腋窝淋巴结显色,观察其周围解剖结构。在保留腋窝淋巴结血管蒂的基础上彻底清扫淋巴结周围的淋巴管,将带血管蒂的淋巴结转移、固定到新的部位,模拟淋巴结移植过程,建立大鼠腋窝淋巴结移植模型。通过于患肢前掌皮下注射0.2m13%偶氮蓝溶液,比较模型组、腋窝淋巴结清扫组、空白对照组大鼠腋窝结构显色情况以及经处理的大鼠血液样本在620nm下的吸光度,分析该模型对于腋窝淋巴结周围淋巴管清扫的彻底程度,从而验证模型的有效性。结果皮下注射偶氮蓝后腋窝淋巴结移植组大鼠腋窝结构显色情况及其经处理的血液样本在620nm下的吸光度均与腋窝淋巴结清扫组相似,与空白对照组有显著差异。结论本实验成功建立了大鼠腋窝淋巴结移植模型,该模型能有效地损伤腋窝淋巴结周围的淋巴管,模拟淋巴结移植的过程。第二部分VEGF-C基因过表达的腺病毒载体构建及转染目的构建VEGF-C基因过表达的腺病毒载体,并使其转染大鼠腋窝淋巴结移植模型的移植淋巴结。方法以AdMax系统构建融合Flag标签的VEGF-C基因过表达腺病毒载体,对照组为过表达Flag标签的腺病毒载体。向大鼠腋窝淋巴结移植模型的淋巴结内注射1.5×108pfu腺病毒,术后3天,摘取淋巴结制成冰冻切片,通过免疫荧光法检测Flag标签的表达。结果成功构建了融合Flag标签的VEGF-C基因过表达腺病毒载体,病毒滴度可达1.5x1011pfu/ml。免疫荧光显示Flag标签在淋巴结中有较强的表达。结论本实验构建了VEGF-C基因过表达腺病毒载体,并成功将目的基因转导至大鼠腋窝淋巴结移植模型的移植淋巴结中。第三部分VEGF-C基因修饰的淋巴结促进淋巴管再生的初步研究目的观察短期内VEGF-C基因修饰的淋巴结在促进淋巴内皮细胞增生、集合淋巴管再生,改善患肢淋巴回流中的作用。方法以免疫荧光法检测基因修饰后1周、2周、4周淋巴结周围组织内淋巴内皮细胞标志物Prox-1及平滑肌细胞标志物a-SMA的表达,观察淋巴内皮细胞增生及集合淋巴管再生情况。通过检测基因修饰后2周、4周偶氮蓝皮下注射后大鼠经处理的血液样本在620nm下的吸光度,观察大鼠患肢淋巴回流功能改善情况。结果实验组大鼠(注射AdVEGFC)术后1周、2周、4周Prox-1的表达明显强于对照组大鼠(注射AdFlag)。实验组及对照组大鼠直到术后4周均未能见到表达Prox-1的淋巴内皮细胞招募表达α-SMA的平滑肌细胞的现象。实验组及对照组大鼠皮下注射偶氮蓝后经处理的血液样本在620m下的吸光度在淋巴结基因修饰后4周内无显著性差异。结论短期内(4周),VEGF-C基因修饰的淋巴结可促进其周围组织内淋巴内皮细胞增生,但未能观察到其促进集合淋巴管再生、改善患肢淋巴回流功能的作用。