背景:对于各类原因导致的终末期心脏功能衰竭,器官移植手术目前最有效的治疗方式。在各种免疫抑制剂的使用下,大部分的急性排斥反应能得到有效控制,但随后发生的慢性排斥反应以及免疫抑制剂相关的副作用,如感染、恶性肿瘤和肾脏毒性,是影响患者预后的主要因素。Nr4A1（Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 1）是一种细胞核孤生受体,在T细胞中具有重要作用,然而Nr4A1缺乏对于T细胞功能的影响和对心脏移植排斥反应的作用,以及Nr4A1的潜在调控机制尚不明确。目的:本课题将使用多种基因敲除小鼠建立心脏移植模型,研究T细胞中Nr4A1缺乏对于心脏移植排斥反应的影响,明确Nr4A1在T细胞中的作用机制,寻找调控Nr4A1的潜在上游靶点,为临床移植排斥反应的防治提供新的理论基础。方法:1.构建小鼠异位心脏移植模型并观察Nr4A1的表达变化取Balb/c（H-2^d）小鼠心脏为供体,野生型C57BL/6（B6,H-2^b）为受体,构建腹腔异位心脏移植模型;或体外混合淋巴细胞培养中,qPCR以及流式细胞技术检测CD4⁺T细胞中Nr4A1表达变化。2.体内观察Nr4A1敲除后对心脏移植排斥反应及体内CD4⁺T细胞表型的影响取Balb/c（H-2^d）小鼠心脏为供体,B6;129S2-Nr4A1^tm1Jmi/J(Nr4A1 KO,Nr4A1^-/-)小鼠或免疫重建的B6.129S7-Rag1^tm1Mom/JNju(Rag1^-/-)小鼠做为受体,构建心脏移植模型,观察Nr4A1敲除后,体内CD4⁺T细胞表型变化以及对心脏移植排斥反应的影响。3.明确Nr4A1激动剂对CD4⁺T细胞功能以及心脏移植排斥反应的影响取Balb/c（H-2^d）小鼠心脏为供体,野生型C57BL/6（B6,H-2^b）为受体,构建腹腔异位心脏移植模型,应用多种Nr4A1特异性小分子激动剂研究其对心脏移植排斥反应的影响;同时,体外提取原代CD4⁺T细胞并使用激动剂干预,流式细胞技术检测T细胞表型改变。4.细胞水平探究Nr4A1的潜在调控靶点使用临床上常用的免疫抑制剂,观察其对CD4⁺T细胞Nr4A1表达的影响,并通过分子生物学Western Blot、qPCR检测CD4⁺T细胞内Nr4A1的表达调控方式,生物信息学分析Nr4A1的潜在上游靶点,最后通过细胞转染以及双荧光素酶报告基因实验验证上游靶点的有效性和特异性。5.构建microRNA拮抗剂观察其对心脏移植排斥反应的影响根据前文实验结果,确定目标microRNA是Nr4A1的潜在上游靶点,构建特异性microRNA拮抗剂,在体内水平观察其对Nr4A1的表达调控作用以及对心脏移植排斥反应的影响,并通过Nr4A1^-/-小鼠验证特异性microRNA拮抗剂的保护作用对Nr4A1的依赖性。结果:1.Nr4A1在心脏移植后受体免疫器官以及体外淋巴细胞混合培养的CD4⁺T细胞中表达显著上调;2.Nr4A1敲除后,心脏移植排斥反应加重,且Nr4A1敲除鼠对于成熟的移植耐受诱导方案产生抵抗;3.细胞过继重建小鼠免疫系统实验证明,Nr4A1主要影响CD4⁺T细胞活化后凋亡以及Tregs细胞亚群分化而影响排斥反应进程;4.Nr4A1受目前最常用的免疫抑制剂—FK506,转录后水平的调控,且FK506通过上调miRNA let-7a发挥Nr4A1转录后抑制作用;5.MicroRNA let-7a拮抗剂可减轻心脏移植排斥反应,联用microRNA let-7a拮抗剂可减少FK506的使用,并增加移植物存活时间。6.MicroRNA let-7a拮抗剂通过上调Nr4A1蛋白表达,实现对心脏移植物的保护作用。结论:Nr4A1在CD4⁺T细胞介导的心脏移植排斥反应中具有重要作用,Nr4A1缺乏可抑制CD4⁺T细胞活化后凋亡以及Tregs细胞亚群分化,加重排斥反应的发生。临床上常用的免疫抑制剂FK506,可通过上调microRNA let-7a抑制Nr4A1转录后翻译过程,使用microRNA let-7a特异性拮抗剂可逆转FK506对于Nr4A1的抑制作用,从而显著延长移植物存活,增强FK506的治疗效果。Nr4A1可能为临床上心脏移植术后,诱导移植物免疫耐受的新靶点。