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目的本研究通过借助宏基因组学测序检测肠道菌群组成及粪菌移植技术建立菌群人源化大鼠模型,旨在探讨体外循环（Cardiopulmonary bypass,CPB）后肠道菌群紊乱可否通过调节肠神经胶质细胞（Enteric glial cell,EGC）的表达促使术后谵妄（Postoperative Delirium,POD）发生。方法本研究经由北部战区总医院伦理委员会批准,于2020年7月～2020年12月收集了符合实验纳入和排除标准的健康志愿者（对照组）及在本院心脏外科行CPB下心脏瓣膜手术后发生POD患者（观察组）的粪便各10例,进行16S r RNA测序分析并制成粪菌滤液,-80℃保存。由辽宁长生生物技术股份有限公司提供SPF级成年雄性SD大鼠30只,体重400～450g,按随机数字表法随机分为3组,分别是伪无菌大鼠组（S组）、伪无菌大鼠+接种健康人源粪菌滤液组（NP组）和伪无菌大鼠+接种POD患者粪菌滤液组（P组）,每组10只。造模前,对各组大鼠进行为期7天,每天4次的水迷宫训练,剔除智能低下或不会游泳者,确保所有组别大鼠的认知功能无统计学差异。S组、NP组和P组给予由氨苄西林（250mg/kg）、硫酸新霉素（250mg/kg）、甲硝唑（250mg/kg）混合配制而成的抗生素鸡尾酒灌胃处理,每日2次,每次2ml,连续14天;S组在为期14天的灌胃完成后即视为造模成功;NP组、P组于第15天开始分别接受来自于健康人源和POD患者源的粪菌移植,每日2次,连续14天。造模成功后,对所有组别大鼠进行Morris水迷宫实验测试并用SUPER MAZE动物行为记录分析系统采集轨迹图像及数据;无菌冻存管收集各组大鼠粪便并存于-80℃冰箱,宏基因组学测序检测肠道菌群变化;脊椎脱臼法处死大鼠,无菌取静脉血、离心后留存血清,酶联免疫吸附（Elisa）法测定血清炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量;小心剥离出左侧大脑半球及长度约2cm的结肠组织若干段,4%多聚甲醛溶液保存,光学显微镜下观察海马CA1、CA3区及结肠粘膜层、粘膜下层和肠肌间神经节丛的形态学变化;取右侧海马及部分结肠组织于-80℃冰箱内保存,Western-blot法检测海马组织中胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）、淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein,APP）及磷酸化Tau蛋白水平,结肠组织中GFAP、钙结合蛋白S100β水平;免疫组化法观察海马中BDNF、GFAP的阳性表达;免疫荧光法观察结肠组织中GFAP的阳性表达。采用Graph Pad Prism 8.0统计软件进行数据分析,符合正态分布的计量数据的平均值（SEM）以均数±标准差（x±s）表示,经Fisher’s精确检验后,多组设计的实验结果分析采用单因素或双因素方差分析、卡方检验,利用Spearman相关性分析探讨肠道菌群与环境因子的关系,ROC曲线分析确定诊断的临界值、敏感性、特异性和准确性;当P<0.05时认为差异有统计意义。结果一、POD患者和健康志愿者肠道菌群测序结果POD患者和健康志愿者肠道菌群的alpha多样性显示各组内无显著差异（P>0.05）;beta多样性显示各组样本各自聚集,区分良好,两组间肠道菌群结构和相对丰度存在明显差异（P<0.05）。与健康志愿者相比,POD患者拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、普雷沃菌属（Prevotella）和大肠杆菌属（Enterobacteriaceae）的相对丰度显著增加,而厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的相对丰度显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。二、大鼠肠道菌群宏基因组学测序结果聚类分析结果显示粪菌移植后三组大鼠肠道菌群各自聚集,分区良好;从门、纲、目、科、属、种6个分类水平分析各组间的肠道菌群分布和相对丰度存在显著性差异（P<0.05）。与S组相比,P组和NP组变形菌门（Proteobacteria）、克雷伯菌属（Klebsiella）、埃希氏菌属（Escherichia）和肠球菌属（Enterococcus）的相对丰度显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）,而P组和NP组间无统计学差异（P>0.05）;与S组相比,NP组厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度显著增高（P<0.05）,而P组与S组间统计无差异（P>0.05）;与S组相比,P组拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和普雷沃菌属（Prevotella）的相对丰度显著增高（P<0.05）,而NP组和S组无统计学差异（P>0.05）。三、大鼠结肠组织各项指标变化（一）HE染色S组出现不同程度的损伤表现,绒毛缩短,神经纤维空泡样变性且排列紊乱;P组肠粘膜层受损缩短,EGC形态形态异常,数量增多,排列不规律;NP组粘膜层变厚,EGC形态规整,排列均匀整齐,依稀可见其突起包绕神经节组成神经丛。（二）Western-blot法检测EGC特异性蛋白GFAP、S100β表达与S组相比,P组和NP组结肠组织GFAP、S100β蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与NP组相比,P组结肠组织GFAP、S-100β蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（三）免疫荧光法检测EGC的特异性标志物GFAPS组结肠粘膜层及粘膜下层神经元周围胶质细胞体积缩小,数量减少,单个细胞无法识别,荧光度低;而与S组相比,P组和NP组GFAP蛋白荧光强度明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与NP组相比,P组EGC胞体增大,反应性增生,GFAP蛋白相对荧光强度明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。四、各组大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α浓度的比较与S组相比,P组和NP组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度均降低,差异有统计学意义（P<0.05）;与P组相比,NP组大鼠术后7天血浆IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。五、大鼠与认知功能相关的各项指标变化（一）大鼠Morris水迷宫定位巡航实验在定位巡航实验中,比较S组、P组和NP组大鼠的平均游泳速度和平均潜伏期,发现造模前三组间无统计学差异（P>0.05）;在平均游泳速度的比较,发现三组大鼠造模后与造模前相比无统计学差异（P>0.05）,三组间的比较也无统计学差异（P>0.05）;在平均潜伏期方面的比较,S组造模后比造模前明显延长,差异有统计学意义（P<0.05）,P组和NP组造模前后无统计学差异（P>0.05）;与S组造模后相比,NP组造模后平均潜伏期明显缩短,差异有统计学意义（P<0.05）,P组与S组间无统计学差异（P>0.05）;与P组造模后比较,NP组造模后平均潜伏期明显缩短,差异有统计学意义（P<0.05）。（二）大鼠Morris水迷宫空间探索实验在空间探索实验中,比较三组大鼠造模前兴趣象限游泳距离、逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间,发现各组间无统计学差异（P>0.05）;S组和P组造模后兴趣象限游泳距离、逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间均比造模前明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）,NP组造模前后的各项指标无统计学差异（P>0.05）;与S组造模后兴趣象限游泳距离、逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间相比,NP组造模后的各项指标均明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）,P组与S组间无统计学差异（P>0.05）;与P组造模后兴趣象限游泳距离、逃生平台穿越次数和兴趣象限停留时间比较,NP组造模后的各项指标均有所增加,差异有统计学意义（P<0.05）。（三）大鼠海马组织HE染色S组可见细胞形态呈锥形,排列疏松紊乱不规则,染色颜色明显加深,神经胶质细胞间隙增宽、神经纤维网疏松,呈海绵状或空泡样;P组细胞胞浆染色不均匀,可见核固缩、核浓染的神经元;NP组细胞排列相对规则,胞浆染色均匀,可见大量正常细胞。（四）免疫组化法检测大鼠海马组织与认知功能相关特异性标志物BDNF、GFAP的表达与S组相比,P组和NP组BDNF阳性表达均增加,GFAP阳性表达均降低;而与P组相比,NP组BDNF阳性表达增加,GFAP阳性表达降低。（五）Western-blot法检测大鼠海马组织与认知功能相关特异性蛋白GFAP、BDNF、APP和磷酸化Tau蛋白的表达与S组相比,P组和NP组海马组织BDNF表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与P组相比,NP组BDNF表达水平升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与S组相比,P组和NP组海马组织GFAP、APP和磷酸化Tau蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义（P<0.05）;而与P组相比,NP组海马组织GFAP、APP和磷酸化Tau蛋白表达水平下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论一、体外循环下心脏手术后发生POD的患者肠道菌群存在变异,拟杆菌门、变形菌门、普雷沃菌属和大肠杆菌属的相对丰度显著增加,而厚壁菌门、放线菌门和双歧杆菌属相对丰度显著降低。二、体外循环心脏手术后发生的变形菌门、普雷沃菌属、肠杆菌属和拟杆菌属等相对丰度的增加,可导致EGC的过度表达,破坏肠屏障功能,产生炎症反应,导致Aβ蛋白在致密斑的聚积及Tau蛋白的高度磷酸化,从而促进POD的发生。