肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）是胸心外科手术的常见并发症，可引起包括ATII在内的肺泡上皮的广泛受损，随着肺移植、袖状切除术、体外循环等技术的广泛开展，LIRI对术后肺功能障碍的影响已经引起了胸外科医师的广泛关注。目前研究发现ATII具有潜在的干细胞功能，在肺损伤时可通过其自身增殖等功能而起到修复作用。肺泡由极薄的覆盖气腔表面的99%的肺泡上皮组成，肺泡上皮主要由两种功能和形态完全不同的细胞组成：肺泡I型上皮细胞(alveolar type I cells，ATI)和肺泡II型上皮细胞(alveolar type II cells，ATII)。肺泡I型上皮细胞扁平，数量仅占肺泡上皮细胞的5%，但其覆盖90%以上的肺泡表面，ATI细胞分化程度高，不能更新修复，通常被认为是终末分化细胞。肺泡II型上皮细胞呈圆形或立方形，体积较小，数量占肺泡上皮细胞的15%，但其仅占肺泡面积的5%。ATII具有多种功能：合成和分泌表面活性物质（pulmonary surfactant protein，SP）；肺水转运功能；强大的免疫调节功能；最重要的是，作为肺泡上皮细胞的干细胞，在肺泡上皮的修复中起着重要的作用，肺损伤时，一旦ATI受到损伤，ATII一方面可分化为ATI，另一方面可增殖为新的ATII维持自身的细胞群。他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶HMG-CoA还原酶，使血清胆固醇清除增加，水平降低。辛伐他汀作为他汀类药物的一种，除其传统的降脂作用外，近年来，其非降脂作用越来越受到人们的重视：具有包括抗炎症、清除自由基、改善内皮功能、抗血栓形成、调节免疫等多效作用。研究表明，辛伐他汀可减轻心、脑等脏器的缺血再灌注损伤，但对肺缺血再灌注损伤的影响机制尚不清楚。新近的肺损伤体内实验研究提示，辛伐他汀能明显缓解动物模型LIRI、促进阻塞性肺疾病动物模型肺泡上皮增殖，但在临床试验中辛伐他汀的保护作用仍存争议。近年来，一些临床实验发现辛伐他汀对肺损伤没有保护作用，而在健康志愿者中的研究发现，辛伐他汀在急性肺损伤中改善了器官功能障碍，缓解了脂多糖诱导的肺部炎症。因此，深入研究辛伐他汀对肺泡上皮尤其是ATII的保护作用及其机制仍十分必要。本研究通过建立ATII体外和体内缺氧复氧损伤模型，研究了以辛伐他汀为代表的他汀类药物是否对ATII细胞的缺氧复氧损伤具有保护作用并探寻可能的分子机制。第一部分：辛伐他汀缓解肺泡II型上皮细胞缺血再灌注损伤的机制研究目的：最新的研究表明他汀类药物具有降脂作用以外的特性，如通过抗炎、抗氧化和细胞保护作用从而缓解LIRI。本部分研究的目的是要证明在体外缺氧复氧损伤及大鼠肺缺血再灌注损伤模型中，给予辛伐他汀能通过促进ATII细胞的增殖，减少其凋亡，从而起到保护ATII细胞、缓解LIRI的作用。通过研究PI3K/Akt信号通路和甲羟戊酸通路，证明了辛伐他汀发挥保护作用的可能机制。方法：体外培养人肺泡II型上皮细胞起源的A549细胞和小鼠肺泡II型上皮细胞MLE-12。实验分为空白组（不给予任何处理）；缺氧复氧损伤对照组；辛伐他汀组（Sim组），L-甲羟戊酸组（L-meva组），辛伐他汀+L-甲羟戊酸组（Sim+L-meva组），辛伐他汀+Wortmannin组（Sim+Wort组），Wortmannin组(Wort组)缺氧复氧损伤前半小时加入不同浓度辛伐他汀，在含有95%N2和5%CO2混合气体的缺氧箱内缺氧处理2h，在复氧0h，2h，4h，6h，12h和24h6个时间点检测各项指标。CCK-8法测缺氧2h后复氧不同时间点各组细胞的增殖活力，采用流式细胞仪AnnexinV/PI双染色检测各组细胞凋亡率，Western blot法测定肺泡表面活性蛋白-C（SP-C）与增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达，以及PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。建立大鼠LIRI长期存活模型，将实验动物分成四组：假手术组（Sham组，仅予开胸，n=20）、缺血再灌注组（I/R组，予左侧肺门阻断1h后开放，n=20）、辛伐他汀低浓度组（LSIM组，术前3d开始予辛伐他汀0.5mg/kg/d灌胃持续应用至处死，余处理同I/R组，n=20）、辛伐他汀高浓度组（HSIM组，术前3d开始予辛伐他汀5mg/kg/d灌胃持续应用至处死，余处理同I/R组，n=20）。分别予开胸后及缺血再灌注后4h、1d、3d、7d收集血及左肺组织标本，检测组织髓过氧化物酶（MPO）活性，SP-C/PCNA免疫荧光双染观察ATII增殖情况，动态观察ATII在各时间点的超微结构并进行体视学分析具体包括体积密度（Vv-lb）、表面积密度（Sv-lb）、表面积与体积比（Rsv-lb）以及数密度（Nv-lb）。各组在再灌注4h和3d两个时间点肺组织中SP-C、Akt、P-Akt、P70、P-P70和Caspase-3蛋白表达水平，以及BAL中SP-C蛋白的表达水平。结果：与对照组相比，缺氧前应用低剂量Sim（5-20μmol/L）预处理30min，可以促进A549细胞和MLE-12细胞的增殖并显著抑制缺氧引起的凋亡，上调SP-C、PCNA、p-Akt及下游增殖相关蛋白p-P70、mTOR水平；而高剂量Sim(50-100μmol/L）并没有观察到促进增殖、抑制凋亡的保护作用。给予L-甲羟戊酸竞争性抑制辛伐他汀，可逆转Sim对ATII细胞的保护作用。与Sim组相比，给予PI3K抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）可拮抗Sim的保护作用，表现为SP-C、p-Akt、mTOR及p-P70蛋白水平下调，Caspase-3蛋白表达水平上调。SP-C/PCNA免疫荧光双染结果显示：与I/R组比较，LSIM和HSIM组在缺血再灌注1d、3d、7d后ATII增殖水平均明显增高，HSIM组在缺血再灌注1d、3d后ATII增殖水平较LSIM组明显增高；ATII电镜观察显示：与I/R组比较，LSIM和HSIM组再灌注后4h未见明显的凋亡现象，而在1d、3d和7d均出现了明显的Lb小体数量增加，HSIM组更为明显；体视学分析结果表明：与I/R组相比，LSIM和HSIM组Vv-lb、Sv-lb、Rsv-lb以及Nv-lb在缺血再灌注后4h和3d差异均有统计学意义（P＜0.05）；与I/R组相比，LSIM和HSIM组中SP-C和P-Akt蛋白表达水平在再灌注4h和3d均明显升高；而Caspase-3蛋白表达量仅在再灌注后4h有所下调，P-P70蛋白含量水平则仅在再灌注后3d有所上升，其余时间点未见明显差异；与I/R组相比，BAL中LSIM和HSIM组中SP-C蛋白表达水平在再灌注后4h和3d均明显升高。结论：缺氧复氧损伤前给予辛伐他汀能显著缓解ATII细胞缺氧复氧肺损伤，从而起到缓解LIRI的作用，其机制可能与辛伐他汀活化PI3K/Akt信号通路有关。第二部分：辛伐他汀促进肺泡II型上皮细胞转分化作用的机制研究目的：他汀类药物不依赖于降脂特性的多效性可能对肺泡II型上皮细胞的转分化发挥重要作用。本部分研究的目的是要证明在ATII缺氧复氧损伤模型中，长期给予辛伐他汀能通过TGF-β/Smad通路促进肺泡II型上皮细胞向I型细胞的转分化，从而起到缓解LIRI的作用。方法：体外培养小鼠肺泡上皮细胞MLE-12，建立缺氧复氧损伤模型，实验分组空白组（不给予任何处理）；缺氧复氧损伤对照组；辛伐他汀组（Sim20组），L-甲羟戊酸组（L-meva组），辛伐他汀+L-甲羟戊酸组（Sim20+L-meva组），SB431542组（SB组），SB431542+辛伐他汀组（SB+Sim20组）。MLE-12细胞在缺氧前应用低剂量辛伐他汀（20μmol/L）预处理30min，以后每日以相同浓度辛伐他汀的培养基全量换液，缺氧后在0h，1d，3d和7d共4个时间点收获细胞，流式细胞仪检测肺泡I型/II型上皮细胞表面特异性标志Caveolin-1/Pro-SP-C阳性细胞数百分比，利用免疫荧光双染法观察辛伐他汀在不同时间点对H/R损伤MLE-12细胞Pro-SP-C和Caveolin-1表达的影响。Westernblot法测定Pro-SP-C和Caveolin-1蛋白表达水平，行甲羟戊酸通路竞争实验观察L-甲羟戊酸（L-meva）对辛伐他汀作用的影响，以及加入TGF-β1受体阻断剂SB431542后Pro-SP-C、Caveolin-1、TGF-β1与Smad-4蛋白的表达，另外检测Sim20在不同时间点对正常的MLE-12细胞Pro-SP-C、Caveolin-1、 TGF-β1与Smad-4蛋白的表达水平。建立大鼠LIRI长期存活模型，将实验动物分成三组：假手术组（Sham组，仅予开胸，n=20）、缺血再灌注组（I/R组，予左侧肺门阻断1h后开放，n=20）、辛伐他汀处理组（SIM组，术前3d开始予辛伐他汀0.5mg/kg/d灌胃持续应用至处死，余处理同I/R组，n=20）。分别予开胸后及缺血再灌注后1d、3d、7d收集左肺组织标本，检测ATII在各时间点的超微结构。结果：流式细胞术结果显示：在缺氧复氧早期（0d及1d），Sim组较H/R组Caveolin-1/Pro-SP-C百分比显著降低；至3d和7d百分比则显著升高；Western Blot结果显示：与H/R组相比，Sim组在0d及1d的Pro-SP-C水平最高，至3d和7d则显著下降；相反，Caveolin-1在1d蛋白水平最低，而至3d和7d则逐渐升高；L-meva竞争试验显示：与Sim组相比，Sim+L-meva组在各个时间点Pro-SP-C和Caveolin-1蛋白水平无明显差异；在加入SB431542后，与Sim组相比，Sim+SB组在各个时间点Pro-SP-C和Caveolin-1蛋白表达量无明显差异；SB与Sim+SB组TGF-β1表达甚少， Smad-4表达量也明显减少；在只加Sim处理的各组中，Caveolin-1在3d表达量最高，而Pro-SP-C在1d表达量最高，TGF-β1和Smad-4表现出相同的变化趋势，在3d蛋白表达量最高；ATII的超微结构显示：与I/R相比，辛伐他汀预处理组在再灌注后1d未见明显的转分化现象，而在再灌注3d出现了明显的ATII胞核伸展，板层小体数量减少，微绒毛消失，细胞器减少，胞质内出现吞饮小泡，在缺血再灌注损伤7d，ATII特征性板层小体呈现排空现象，微绒毛消失，细胞器明显减少，而开始出现胞质内含大量吞饮小泡的宽大扁薄形状的ATI细胞。结论：辛伐他汀可以促进缺氧复氧损伤后ATII向ATI的转分化，其机制可能与TGF-β/Smad信号通路相关，而这种机制不依赖于甲羟戊酸通路。