目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是导致组织器官缺血的重要原因,是心脑血管及外周血管最常见的病理改变。动脉硬化闭塞症（atherosclerosis obliterans,ASO）是一种血管外科临床工作中常见的外周血管疾病（peripheral arterial disease,PAD）,近年来发病率逐渐升高。下肢动脉出现粥样硬化后,随着病情进展,管腔逐渐缩小,导致组织缺血,当管腔完全闭塞且侧支循环不能代偿组织供血需求时,最终发生肢体坏死。近年来,虽然血管外科针对下肢ASO的开放手术和腔内治疗技术已取得长足进步,但ASO患者远期预后仍不理想,无论以传统手术还是腔内技术对下肢血运进行重建,都无法避免因血管重塑导致的术后再狭窄发生。因此,血管重塑机制的研究对于改善下肢ASO患者治疗方法及预后具有重大意义。自血管外科发展至今,作为血管外科临床治疗的重难点,血管负性重塑一直是一线血管外科医生的重大挑战。病理性血管负性重塑是下肢ASO的主要病理改变,其中心环节包含内膜新生、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）过度增殖、表型转化和迁移等多个病理性过程。因此,探究VSMCs病理性增殖的机制是解决病理性重塑问题的关键。随着对人类基因研究的不断深入,人们发现非编码RNA（non-codingRNAs,ncRNAs）,尤其是微小RNA（microRNAs,miRs）与VSMCs过度增殖和表型转化密切相关。研究表明,miRs作为重要调控因子参与了转录、翻译和蛋白降解。2013年就有研究表明,miR-455在大鼠再狭窄模型中高表达,且表达差异大于两倍,且已有多篇报道证实miR-455参与肿瘤细胞增殖过程,而VSMCs增殖是ASO发生发展的重要环节之一。因此本研究旨在探究讨论miR-455对VSMCs增殖及表型转化的作用及其上下游相关因子在病理性血管重塑中扮演的角色。方法:为了研究miR-455与病理性血管重塑的关系,我们收集了下肢ASO患者的病变血管组织及器官捐献供体健康动脉组织,同时建立了大鼠颈动脉球囊损伤模型和人主动脉平滑肌细胞增殖模型,检测了人与大鼠的血管组织和VSMC中miR-455的表达。为了进一步探究miR-455的功能,我们在人主动脉平滑肌细胞系T/G HAVSMC中过表达miR-455,评估细胞增殖能力、分泌表型标志物和收缩表型标志物表达水平。为进一步探究miR-455调控细胞增殖和表型转化的机制,我们应用在线软件Target Scan和DIANA从生物信息学角度分析miR-455的潜在靶基因,并应用双萤光素酶报告基因进行验证。为了明确miR-455上游调控机制,我们应用生物信息学软件JASPAR对其上游转录因子进行了预测,预测到p65与miR-455启动子区具有潜在结合位点,并用萤光素酶报告基因和染色质免疫沉淀技术（ChIP）进行了验证。为了进一步探究p65对T/G HA-VSMC增殖和表型转化的作用,我们向上述细胞中转染p65 cDNA,评估转染后miR-455水平、细胞增殖水平、细胞表型标志物表达水平。最后,为了研究miR-455在体对血管狭窄的影响,我们构建了大鼠颈动脉球囊损伤模型,并在造模同时局部转染miR-455 agomir/antagomir/NC,并检测颈动脉中miR-455、平滑肌表型标志物、PTEN的表达水平,评估血管狭窄程度。通过CCK-8实验评价细胞活力和增殖水平;运用流式细胞仪检测细胞周期分布;蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测蛋白表达量变化,各指标RNA表达水平应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。实验结果均使用均值±标准差表示,两组间比较采用t检验,多组间两两比较采用单因素方差分析。当P<0.05时认为统计学差异显著。统计学处理由SPSS 23.0软件和Graph Pad Prism 8软件完成。结果:采集ASO患者病变下肢动脉和器官捐献供体健康动脉组织、大鼠颈动脉球囊损伤模型颈动脉及假手术组颈动脉,提取动脉组织中RNA进行检测,RT-qPCR结果显示ASO患者病变下肢动脉中hsa-miR-455表达水平显著高于健康动脉,大鼠球囊损伤颈动脉中rno-miR-455表达水平显著高于对照组。同时构建人T/G HAVSMC增殖模型,qPCR结果显示模型组hsa-miR-455表达水平显著高于对照组。CCK-8实验证实过表达hsa-miR-455后,显著促进了T/G HA-VSMC细胞增殖,使用蛋白质免疫印迹实验检测血管平滑肌表型标志物α-SMA、OPN及PTEN,亦发现过表达hsa-miR-455后OPN水平显著上调,α-SMA和PTEN水平显著下调。生物信息学预测结果提示,PTEN-3’UTR和miR-455存在潜在结合位点,依据前述生物信息学预测结果,构建双萤光素酶质粒,发现miR-455 mimics抑制野生型质粒的萤光素酶活性效应明显,反之,其对突变型质粒的萤光素酶活性抑制作用不显著。另外,生物信息学预测结果提示p65与miR-455启动子区存在潜在结合位点,ChIP和萤光素酶报告基因结果显示预测位点有效,p65可以与miR-455启动子区结合并促进miR-455转录。RT-qPCR证实在T/G HA-VSMC中过表达p65后hsa-miR-455水平显著上调,同时蛋白免疫印迹实验检测到PTEN和α-SMA表达水平下调,OPN表达水平上调,当同时过表达p65和hsa-miR-455时,PTEN和α-SMA表达水平进一步下调,OPN表达水平进一步上调。流式细胞仪检测细胞周期,结果显示同期过表达p65和hsa-miR-455组S期细胞比例显著高于p65过表达组,证实hsa-miR-455是p65调控T/G HA-VSMC细胞周期、表型转化及PTEN表达水平的重要调控因子。免疫组化实验结果显示,对球囊损伤的大鼠颈动脉局部转染rno-miR-455 agomir后,组织中PTEN和α-SMA水平下调,OPN水平上调,反之,转染rno-miR-455 antagomir后,组织中PTEN和α-SMA水平上调,OPN水平下调。同时,对rno-miR-455调控动脉负性重塑的效应进行评估,结果显示,rno-miR-455 antagomir可以显著缓解大鼠颈动脉球囊损伤所致的动脉狭窄。结论:miR-455在狭窄动脉和异常增殖的VSMC中高表达;体外实验,过表达hsamiR-455可以促进T/G HA-VSMC增殖及表型转化,并通过与PTEN-3’UTR结合下调其表达水平;hsa-miR-455可以介导p65调控的T/G HA-VSMC增殖及表型转化,与p65促增殖和表型转化的效应起协同作用;体内实验,大鼠颈动脉球囊损伤模型局部转染rno-miR-455 agomir可以下调局部PTEN水平、调控局部血管平滑肌表型转化,从而减轻由于球囊损伤造成的动脉狭窄。上述结果将转录因子、微小RNA以及蛋白编码RNA联系起来,进一步明确了miR-455在VSMC增殖及表型转化中扮演的角色和作用机制,为血管再狭窄及其它血管负性重塑性疾病提供了精准治疗的潜在靶点和新思路。