心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)是心肌中数量最多的一类细胞,约占心脏细胞总数的60%-70%。CFs遍布于心肌组织之中,包绕着心肌细胞并与心肌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)相连接。CFs的生物学功能极为广泛,能够调控细胞外基质(extracellular matrix, ECM)代谢、合成分泌多种细胞因子、介导心肌机械／电信号传导,并参与血管新生调控等过程,在心脏正常生理机能的维持及心室重构过程中发挥着重要作用。心室重构是多种心脏疾病的共同结局,其过程常伴有心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)的发生。CFs在MF中扮演着重要角色。病理因素刺激下,CFs会发生表型转化,活化为心脏肌成纤维细胞(cadiac myofibroblasts, CMFs)。CMFs具有更强的增殖能力、更易于发生迁移、合成ECM及对ECM代谢具有重要调节作用的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)增加而参与心室重构过程。另外,CMFs还分泌大量的生长因子和细胞因子,通过自分泌和旁分泌效应,作用于心肌组织中的各种靶细胞,从而进一步推动心室重构的发展。尽管在最初,CFs生物学性状和功能的诸多改变有益于受损心肌组织的修复和心功能的维持,其长期效应则导致心肌僵硬度的不断增高,心脏功能障碍的发生,并最终导致心力衰竭(heart failure, HF)。因此,以CFs为靶标的抗MF、心功能保护药物的开发已成为目前心血管疾病治疗领域极具潜力的方向。吡非尼酮(Pirfenidone)为新型小分子抗纤维化药物。在不同种属动物上,采用多种不同建模方法所致MF模型中的研究结果表明,吡非尼酮能够显著减轻MF的程度、改善心功能、逆转心室重构进程。CFs在MF过程中居于核心地位,在心室重构中发挥着关键作用。尽管已有为数较多的体内实验证据表明吡非尼酮具有抗MF作用,并且CFs可能是其作用的主要靶细胞,但吡非尼酮是否能够直接影响CFs的生物学功能,以及其作用的具体机制为何,目前尚无研究报道。因此,本研究的主要目的为探讨吡非尼酮对体外分离培养的CFs的生物学功能,主要是在心室重构过程中具有重要意义的一些功能,包括增殖、表型转化、胶原收缩、细胞因子分泌等的影响,以及其可能的作用机制,为将来吡非尼酮应用于临床抗MF治疗提供实验依据。本研究的主要结果如下：(1)吡非尼酮能够显著抑制体外培养的CFs的增殖,降低Ki67阳性细胞比率,且其效果并非由细胞毒性所致。吡非尼酮能够显著抑制CFs向CMFs的表型转化过程,降低α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,另外,毗非尼酮处理后CFs的胶原收缩能力、细胞迁移能力均显著减弱。以上结果表明,吡非尼酮能够直接影响CFs的生物学功能,从而发挥其抗MF,逆转心室重构的作用。(2)吡非尼酮降低了MMP-9的合成和分泌,相反地,升高了TIMP-1的合成和分泌,即吡非尼酮降低了CFs中MMP-9/TIMP-1的比率。MMP-9/TIMP-1比率在心室重构过程中上调,对于ECM代谢及CFs迁移等具有重要调节作用,逆转MMP-9/TIMP-1比率可能是吡非尼酮抗MF的重要分子机制之一。(3)吡非尼酮降低了CFs中TGF-p1的合成和分泌,相反地,升高了IL-10的合成和分泌。TGF-β1在MF中具有关键作用,被认为是最重要的促纤维化细胞因子,IL-10则具有抗炎症、抗纤维化作用,因而吡非尼酮对CFs合成分泌TGF-β1、IL-10的调控作用可能是其抗MF机制的另一个重要方面。以上结果表明,吡非尼酮对CFs的功能具有直接影响,在细胞水平上,吡非尼酮能够抑制CFs的增殖、胶原收缩及迁移能力；在分子水平上,吡非尼酮能够降低α-SMA的表达,下调MMP-9/TIMP-1比率,抑制促纤维化细胞因子TGF-β1的表达并促进抗炎症、抗纤维化因子IL-10的表达。近年来,随着基因组学及蛋白质组学的发展,心室重构及心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)相关基因的筛选鉴定工作取得了很大突破。有研究报道,在多种心脏病、MF模型心肌组织中转化生长因子β诱导基因22(TGF-p stimulated clone-22, TSC-22)表达上调,并推测其可能参与了MF过程的调控。与这些报道相一致,前期工作中我们也发现了TSC-22在有明显MF表现的心力衰竭(heart failure, HF)病人心肌组织中表达上调,但TSC-22在心肌损伤后的表达变化规律,以及其在MF的关键细胞——CFs中的表达调控因素及发挥的生物学功能尚不清楚。因此,本研究旨在探讨TSC-22蛋白水平的表达在心肌梗死(myocardial infarction, MI)后到HF发生过程中的动态变化规律、诱导其在CFs中表达的因素和机制,以及其在CFs中发挥的生物学功能,为心室重构及MF治疗提供新靶标。动物实验结果表明：大鼠MI后TSC-22蛋白在心肌组织中的表达呈动态变化,其表达在MI后1天、7天时上调,而在4周时下降。体外实验结果表明,TGF-β1通过TGF-β1I型受体,诱导TSC-22在CFs中的表达,且促使其亚细胞定位发生变化,主要在细胞核中表达；另外,接触抑制情况下,TSC-22在CFs中的表达也显著升高。另外,在CFs中转染TSC-22特异小干扰RNA(small interfering RN A, siRNA)敲低TSC-22表达后,TGF-β1诱导下CFs中α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)的表达显著下降,这一结果提示TSC-22介导了TGF-β1诱导下的CFs向心脏肌成纤维细胞(cadiac myofibroblasts, CMFs)表型转化的过程,在其中为正性调节因子。以上结果表明,TSC-22蛋白在MI后呈动态变化规律,在急性MI期表达上调,而当发生HF时下降。在MI后不同时相中TSC-22表达水平的不同,提示其可能在不同的病理阶段中发挥着不同的生物学作用。TGF-β1及接触抑制能够诱导TSC-22在CFs中表达上调,可能是MI及其他心肌损伤或心肌病中TSC-22表达升高的重要诱导因素。细胞功能学实验结果表明,TSC-22介导了TGF-β1诱导下的CFs-CMFs表型转化过程。因此,TSC-22有望成为一个新的分子靶标,将来在临床中应用于MF的干预治疗。