反式翻译系统是细胞内最主要的核糖体拯救系统,它由两个部分组成,包括一个小蛋白 SmpB(Small protein B)和转移-信使 RNA(Transfer-massage RNA,tmRNA)。在核糖体发生滞留后,SmpB与tmRNA可以结合到核糖体上,释放核糖体并给未翻译完成的肽带上水解标签,这些肽即为反式翻译底物。这些反式翻译的底物并不是随机的而是具有特异性的,在不同物种和同一物种的不同培养条件中都具有较大的差异。越来越多的研究表明,核糖体滞留是细菌细胞在转录后阶段调节基因表达的有效手段,故而反式翻译也被认为可能与参与了基因表达的转录后调控。反式翻译被检测到与细菌的生长、毒力、对逆境的的胁迫应答等生理活动息息相关,在耐药细菌逐渐泛滥成为威胁人类健康重大隐患的今天,反式翻译系统无疑成为了新药物开发的潜在靶标。前期实验表明,反式翻译对于鱼类病原菌维氏气单胞菌有着重要意义,失去反式翻译的维氏气单胞菌毒性减弱,并且对多种抗生素的敏感度增加。为了更进一步了解维氏气单胞菌细胞中反式翻译的生理功能,本文对维氏气单胞菌的反式翻译底物展开了研究,共包含3个部分:(1)构建了一个tmRNA突变体,其标记肽的后6位氨基酸序列(包含水解酶识别位点)突变为了 His6标签,从而使得这些被反式翻译拯救后的肽段不会被降解并且可以通过镍柱进行纯化收集。将构建好的tmRNA突变体在维氏气单胞菌tmRNA敲除型(⊿tmRNA)菌株中进行表达,生长曲线和western blot实验都表明,突变后的tmRNA可以替代野生型tmRNA发挥反式翻译的作用,并给细胞内的反式翻译底物标记上His6标签。(2)利用镍柱纯化了被标记的蛋白,并进行了质谱鉴定,通过3次与野生型对照组的质谱结果比对,得出16个可能的反式翻译底物。我们从中选取了噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)来进行验证试验,结果表明PspA的确会被反式翻译系统所拯救,并且鉴定到标记肽的标记位点为Ala126。(3)对质谱的数据分析方法进行了优化,通过构建理论切割数据库,通过单次质谱检测即直接可得到纯化样品中带有标记肽序列的蛋白,并能同时定位标记肽标记的位点。最后从中发现了膜组装蛋白(membrane assembly protein,AsmA)的标记位点为Ser631。通过预测,发现该位点的下游存在一颈环结构,故推测可能是由于该mRNA的二级结构导致了核糖体滞留,本文也由此提出了 AsmA蛋白在翻译过程中引起核糖体滞留并被拯救的模型。该研究为进一步了解反式翻译在维氏气单胞菌中的生理功能提供了基础,也在一定程度上揭示了反式翻译与转录后基因表达调控之间的关联。