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木糖醇是一种五碳糖醇,其化学名称为1,2,3,4,5-戊醇,分子式为C5H1205,是一种白色结晶,它的溶解度、溶液密度和折光系数等理化性质与蔗糖基本相同,可以作为蔗糖的替代品和糖尿病人的营养剂而受到人们的关注。本文首先通过PCR从粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)基因组中获得目的基因木糖还原酶基因(Xr),构建表达质粒pET30a-xr,并分析重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。结果表明分子量大小为38kDa的木糖还原酶(XR)能有效表达,重组菌株XR的比酶活为7.25U/mg。其次,XR为NADPH依赖型的酶,本文通过PCR从大肠杆菌K-12基因组中分别获得辅酶再生基因6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf),构建表达质粒pCDFDuet-gnd、pCDFDuet-zwf、 pCDFDuet-gnd-zwf,并分析重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。结果表明分子量大小为51kDa的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)、54kDa的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)均得到有效表达,重组菌株6-PGDH的比酶活为2.26U/mg,G6PDH的比酶活为1.31U/mg。论文通过共表达pET30a和pCDFDuet-1系列的载体,强化了NADPH的再生,提高木糖醇的转化效率。在此基础上,论文优化了表达细胞的木糖代谢途径,采用Red/ET技术成功敲除了大肠杆菌基因组中D-木酮糖激酶(XK)的基因(xylB),减弱了木糖通过木酮糖的磷酸化生成5-磷酸-D-木酮糖进入磷酸戊糖途径,被菌体生长代谢利用。论文通过比较xylB基因敲除前后木糖对木糖醇的转化率,明确了基因敲除对提高木糖的利用效率和木糖醇产率的作用。最后,论文通过对培养基组成及培养条件(种龄、初糖浓度、温度、pH和接种量等)的优化,获得了工程菌生物转化生产木糖醇的最佳条件：种龄为12h,初糖浓度为60g/L,温度为28℃,pH为7.0,接种量为10%。摇瓶发酵结果显示,优化前重组菌株产木糖醇的生产速率是0.88g/(L·h),优化后木糖醇的生产速率是1.04g/(L·h),提高了24.32%。