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1目的:1.1巨噬细胞M1/M2转录信号调控的基因表达研究显示,DN（Diabetic Nephropathy,糖尿病肾病）的发生与炎症过程密切相关,该过程与巨噬细胞极化至不同分型相关:M1（classical activated macrophages,经典活化型）参与炎症反应造成组织损伤;M2（alternatively activated macrophages,替代活化型）可抑制炎症作用从而修复组织损伤。DN肾组织中M1/M2表型失衡,且以M1型浸润为主。寻找与M1/M2表型相关的基因并进行干预,是目前治疗DN的研究热点。本研究的第一部分将基于GEO（Gene Expression Omnibus,基因表达综合数据库）数据库,首先探讨巨噬细胞极化至不同分型时的基因表达变化。1.2 HSYA调节高糖诱导的RAW264.7细胞分型保护足细胞损伤的作用目前研究显示,HSYA（Hydroxysafflor yellow A,羟基红花黄色素A）能够治疗糖尿病。我们前期工作发现,HSYA可抑制LPS（Lipopolysaccharide,脂多糖）诱导的巨噬细胞M1分型。在DN的发展过程中,足细胞损伤是中心环节,巨噬细胞极化至M1、M2不同表型时,对足细胞损伤具有不同的作用。HSYA对高糖所致的足细胞损伤有何作用?M1/M2分型发挥何种作用?为阐明HSYA的以上作用机制,本研究的第二部分将基于文献检索、前期结果、M1/M2分型的基因表达变化,研究HSYA对高糖所致足细胞损伤的直接作用及经M1/M2分型的间接作用。2方法:2.1巨噬细胞M1/M2转录信号调控的基因表达（1）在 Array Express（https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress）中,分别以关键词macrophage differentiation、macrophage polarization、macrophage phenotype、macrophage subtype、M0（巨噬细胞静息状态）、M1、M2等,检索相关数据集。（2）将检索到的相关数据集用 Accession、Organism、Cell type、Treatment 等分类进行筛选,数据集筛选标准如下:①Organism为小鼠;②Cell type为骨髓来源巨噬细胞;③Treatment以M0分别为M1及M2的对照。（3）将筛选得到的数据集链接至对应的GEO数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）,通过GEO2R（http://www.ncbi.nih.gov/geo/geo2r）,按照对照组为M0,实验组为M1及M2进行分组检索,得到M1/M2分型的DEGs（differentially expressed genes,差异基因）,adj.P<0.01 的DEGs 为具有统计学意义,其中log FC>0视为基因上调,log FC<0视为基因下调。（4）使用GO（The Gene Ontology,基因本体联合会建立的数据库）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书）,对 DEGs参与的生物过程及功能进行分析。2.2 HSYA调节高糖诱导的RAW264.7细胞分型保护足细胞损伤的作用（1）Griess法测定NO（Nitric oxide,一氧化氮）含量,确定RAW264.7巨噬细胞向M1型转化的高糖浓度。（2）CCK8法确定高糖环境下,HSYA对巨噬细胞的安全作用浓度。（3）Western Blot及PCR测定在高糖作用下,M1型极化的标志物TNF-α（Tumor necrosis factor-α,肿瘤坏死因子-α）和 iNOS（inducible nitric oxide synthase,诱导型一氧化氮合酶）、M2型极化的标志物CD206（mannose receptor 1,甘露糖受体）和Arg-1（Arginase 1,精氨酸酶1）的蛋白及mRNA的表达变化,并检测HSYA对以上标志物的影响作用。山奈酚为阳性对照。（4）用高糖及高糖处理过的巨噬细胞上清液（（高糖）MS）分别培养足细胞,MTT法研究足细胞的生存率,并用Elisa法检测足细胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量。3结果:3.1巨噬细胞M1/M2转录信号调控的基因表达（1）根据筛选标准,本研究获得题目为“Control of the inflammatory macrophage transcriptional signature by miR-155”的数据集 GEO77425。（2）M1型中,IL-1β和TNFR（TNF受体）家族的基因全部上调。根据log FC,IL-1β排在M1型上调的第二位,IL-1α排在M1型上调的第十位。（3）M2 型的主要上调基因为 Arg-1、Retnla、Rnase2a 等,根据 log FC,Arg-1排在M2上调基因的第一位。（4）GO和KEGG结果显示,M1/M2极化相关基因富集于CC（Cell Component,细胞成分）的 cytoplasm,MF（Molecular Function,分子功能）的 protein binding,BP（Biological Process,生物过程）的 cell cycle、inflammatory response 和 KEGG 的TNF signaling pathway。3.2 HSYA调节高糖诱导的RAW264.7细胞分型保护足细胞损伤的作用（1）33.3 mM的葡萄糖浓度可使RAW264.7细胞向M1型转化。（2）33.3 mM葡萄糖时,HSYA作用于巨噬细胞的安全浓度为100-300 μM。（3）与11.1 mM葡萄糖正常对照组相比,33.3 mM高糖使iNOS、TNF-α的蛋白及mRNA表达均显著增加（P<0.05）,Arg-1、CD206的蛋白及mRNA表达均显著降低（P<0.05）。与高糖模型组相比,HSYA能显著增加CD206的蛋白及mRNA表达（P<0.05）,显著降低iNOS和TNF-α的蛋白及mRNA表达（P<0.05）。（4）高糖直接作用于足细胞24 h后,足细胞存活率为（80.1±11.2）%,显著低于11.1 mM对照组的（100.0±0.0）%（P<0.05）。HSYA在100 μM时,足细胞的存活率为（92.5±10.5）%,与高糖组相比显著增高（P<0.05）。（5）用（高糖）MS培养足细胞24 h后,足细胞的存活率降至（57.3±1.7）%,显著低于（对照组）MS的（95.7±4.0）%（P<0.05）,与（高糖）MS相比,（HSYA 100 μM）MS的存活率显著增加至（（88.6±11.2）%,P<0.05）。（6）与对照组相比,高糖及（高糖）MS均使足细胞上清液中的TNF-α和IL-1β的含量增加,100 μM和200 μM的HSYA及（HSYA）MS均能显著降低高糖及（高糖）MS诱导的足细胞TNF-α和IL-1β的产生（P<0.05）。4结论:4.1巨噬细胞M1/M2转录信号调控的基因表达（1）IL-1、TNF等标志物升高是M1型的关键基因,Arg-1等标志物升高是M2型的关键基因。（2）M1和M2表型关键标志物的改变与体内炎症过程和免疫过程相关。4.2 HSYA调节高糖诱导的RAW264.7细胞分型保护足细胞损伤的作用（1）100 μM HSYA对33.3 mM高糖所致的足细胞损伤具有直接的保护作用。（2）100-200 μM HSYA通过调节33.3 mM高糖诱导的M1/M2极化后iNOS、TNF-α、Arg-1和CD206的蛋白及mRNA表达,间接发挥保护足细胞损伤的作用。（3）以上的直接与间接作用,均与HSYA降低TNF-α和IL-1β的作用相关。