基于RNA结合蛋白的MicroRNA富集与检测技术的研究

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MicroRNAs (miRNAs)是一类存在于真核生物中进化保守并具有调控功能的非蛋白质编码短链RNA(长度约为19~23个核糖核苷酸)。大量数据证明,癌症的发生发展往往伴随着miRNA的异常表达,故将miRNA作为生物标志物用于癌症诊断预测和治疗反应等是十分有意义的。RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBPs)是一类与RNA分子特异性结合的蛋白质。基于RNA结合蛋白的这一特征,将其用于富集检测miRNA成为一种新的发展方向。基于p19蛋白结合双链RNA的特点,我们开发了一种p19蛋白增强荧光偏振信号快速检测miRNA的方法。p19蛋白并不结合于ssRNA、rRNA、mRNA、ssDNA或者dsDNA,而是以高亲和力结合19~21个碱基长度的双链RNA。利用这一特性,我们将miRNA与荧光探针的结合产生荧光偏振信号,再与p19蛋白结合进一步放大荧光偏振信号达到快速检测miRNA的目的。该方法可在常温下以“混合—测量”模式,3min内检测到低至10pM的miRNA。血液中miRNA大量稳定存在的原因在于miRNA多数以Ago2-miRNA复合物的形式存在。基于这一特点我们用免疫沉淀Ago2-miRNA复合物的方法来富集人体样本例如血液和癌细胞当中的miRNA。通过免疫沉淀条件的优化,该方法免疫沉淀效率达到了85%以上,可以在2×105癌细胞中富集得到0.15μg以上的Ago2-miRNA复合物。
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