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真菌漆酶虽已商业化,但由于在碱性环境下活性很低甚至完全失活,热稳定性也较差,大大限制了在工业印染废水处理中的应用价值,且真菌漆酶有糖基化修饰,不利于分子改造操作。相较之下,细菌漆酶(如Cot A漆酶)虽比真菌漆酶天然活性低,但在碱性pH及高温下具备相对高酶活,热稳定性也非常好,更适合在印染废水处理中推广应用,而且细菌漆酶无糖基化修饰,适于酶工程改造。本研究通过推理假设和理性设计的方法来尝试提高短小芽胞杆菌CotA漆酶的催化活性,并解决突变导致的热稳定性下降问题。论文主要研究结果如下:(1)通过定点突变方法构建出短小芽胞杆菌W3菌株的Cot A漆酶双突变体L386W/G417L,与野生型Cot A漆酶(wild-type,WT)相比较,L386W/G417L对底物2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)的催化活性提高到野生型的4.3倍。(2)发现双突变L386W/G417L的热稳定性出现一定程度的下降:当将酶置于80°C水浴中孵育时,野生型和G417L的半衰期(t1/2)分别为1.14和1.47 h,而L386W/G417L的半衰期(t1/2)仅为0.37 h。为改善L386W/G417L的热稳定性,采用基于生物信息学的突变预测和结合实验验证手段最终构建筛选获得了一个热稳定性显著提升的三突变体L386W/G417L/G57F。研究表明,当L386W/G417L/G57F置于90°C水浴孵育2 h后,其半衰期(t1/2)提高到了0.54 h,残余酶活为34%;而L386W/G417L置于90°C水浴孵育5 min后残余酶活剩余不足40%。(3)当以SGZ和DMP作为底物时,与野生型Cot A相比,突变体对其催化效率和专一性均表现降低,表明突变体对底物ABTS亲和性增加的同时,对丁香醛连氮(SGZ)和2,6-二甲基苯酚(DMP)的亲和性有所下降。(4)在对染料脱色研究中,pH 10条件下双突变体L386W/G417L和三突变体L386W/G417L/G57F对多种工业染料均具有较好的脱色性能。综上,Cot A漆酶的三突变体L386W/G417L/G57F具有较高的酶活力和热稳定性,在印染废水的生物强化处理方面具备应用前景。