由代谢酶和转运体介导的体内药动学相互作用是导致药物药效和毒性发生改变的重要原因。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)催化的葡萄糖醛酸结合反应是生物体内重要的Ⅱ相代谢途径,是多种内源性及外源性化合物清除与解毒的机制。UGT的过度表达或抑制可能导致血药浓度的偏低或偏高,引起治疗失败或中毒。其中UGT1A1是体内尤其是肝脏中广泛表达的重要UGT,参与肝脏胆红素和多种药物的体内代谢,与许多肝脏疾病和药物相互作用密切相关。有机阳离子转运体(OCTs)是转运许多重要内源性物质和阳离子药物的转运体,主要包括OCT1、OCT2和OCT3三个亚型。OCTs在体内分布广泛,参与多种内源性物质和药物的体内转运过程,是介导药物相互作用的重要因素之一。这种相互作用一方面可导致药物的药效减弱或毒性增加,另一方面亦可作为降低药物毒副反应的辅助手段。因此,在新药开发过程中,评估药物潜在的相互作用是非常重要的。以前国内外均偏重于研究由CYP450酶介导的药物相互作用,对UGT和OCTs的关注相对较少。近年来随着人们对UGT和OCTs的认识逐渐深入,药物对它们的影响吸引了越来越多研究人员的关注。黄连Coptis chinensis Franch.为著名传统中药,已有2000多年的应用历史,具有清热燥湿、泻火解毒之功效。现代药理学研究表明黄连具有抗菌抗病毒、降血糖、降血压、改善心脑血管疾病和抗肿瘤等作用。异喹啉类生物碱是黄连的主要成分,其中含量较高的为小檗碱(BER)、表小檗碱(EPI)、黄连碱(COP)、药根碱(JAT)和巴马汀(PAL)5种原小檗碱型生物碱,除此之外还有一种阿朴菲型的木兰花碱(MAG)。黄连临床常与其他药物配伍使用,近年来研究发现黄连与其他合用药物可发生显著的代谢性相互作用,现已证实此种相互作用可由CYP450酶介导发生,而UGT是否也参与其中,目前尚不明了。另外,文献报道黄连生物碱与OCTs亦存在相互作用,但现有研究主要局限于体外细胞模型实验上,体内实验数据尚不充分。交泰丸以黄连为君药,为中医治疗“心肾不交”型失眠的经典名方。近期有学者发现OCTs作为单胺类递质非经典转运体,也对其转运发挥重要的作用,并且是中枢相关疾病,如抑郁症等治疗中的重要靶点。而OCTs与“心肾不交”型失眠的相关性以及交泰丸对其存在的调控作用尚待阐明。鉴于此,本文探讨了黄连生物碱与UGT和OCTs的相互作用,以及交泰丸对OCTs的调控作用,对指导黄连临床合理用药、阐释黄连方剂配伍机制及交泰丸催眠作用机制具有重要的意义。第一部分 文献综述此部分对UGT和OCTs及其介导的药物相互作用、黄连与药物代谢酶和转运体相互作用研究进展及交泰丸药理作用及其作用机制研究进展进行了概述。第二部分实验研究1 6种黄连生物碱对鼠肝微粒体UGTs及UGT1A1活性影响的体内外研究为考察黄连生物碱对UGT活性的影响,探讨黄连与其它药物发生代谢性相互作用的可能性,本章实验采用大小鼠肝微粒体,以及生物碱小鼠体内诱导后的肝微粒体,构建微粒体体外代谢模型,以4-硝基酚(4-NP)为底物检测UGTs活性,β-雌二醇为底物检测UGT1A1活性,利用UV和HPLC测定底物(4-NP)或代谢物(β-雌二醇-3-葡糖醛酸苷(E-3-G))含量,以考察6种黄连生物碱对大鼠、小鼠肝微粒体UGTs及UGT1A1活性的体内外影响。结果在大鼠体外实验中,BER、EPI、COP和JAT均可显著抑制UGTs活性,其中EPI抑制作用最强;对UGT1A1,JAT呈弱抑制作用(IC50≈227 μmoh·L-1),而COP和PAL则表现为显著的激活作用。在小鼠体外实验中,BER、COP、JAT和PAL对UGTs呈显著抑制作用,但对UGT1A1,6种生物碱均表现为显著的激活作用。小鼠体内诱导实验中,只有BER对UGTs,JAT对UGT1A1活性呈现显著的升高作用,其他生物碱无明显作用。结果表明6种黄连生物碱对UGT活性具有不同程度的抑制或激活作用,并显示出明显的种属和体内外的差异,这可能是黄连与其他药物发生代谢性相互作用的原因之一。2黄连生物碱与OCTs相互作用的体内实验研究在研究了黄连生物碱与UGT的相互作用后,本章实验继续考察其对OCTs体内活性的影响。选择二甲双胍为OCT1及OCT2的底物,采用HPLC-MS/MS测定空白和生物碱诱导后大鼠二甲双胍的血药浓度和药动学参数的变化,评价黄连生物碱对OCT1及OCT2活性的影响;并采用western blot测定大鼠各组织OCT的表达。结果表明,与空白组相比,生物碱连续腹腔注射大鼠后,除EPI(50 mg·kg-1)外,其他各组生物碱均显著增加二甲双胍的Cmax,AUC0～t和AUC0～∞,并降低其CL和Vz,作用强度为BER(100 mg·kg-1)>BER(50 mg·kg 1)>COP(100 mg·kg-1)≈COP(50 mg·kg-1)≈EPI(100 mg·kg-1)>cimetidine(100mg·kg-)>EPI(50mg·kg-1),而各组对t1/2均无显著性影响。另外,western blot结果显示,各组生物碱均对肾脏OCT2表达存在一定程度的抑制作用,其中BER(100 mg·kg-1)及EPI(100 mg·kg-1)抑制作用最强,而各组对肝脏OCT1表达均无抑制作用,有的反而呈现诱导趋势,如COP(100 mg·kg-1)。另外,除EPI(100mg·kg-1)外,其余各组生物碱亦对心脏OCT3表达存在一定的抑制作用。结果表明黄连生物碱对大鼠体内OCTs活性及表达均存在抑制作用,提示黄连及其生物碱与其他药物存在由OCTs介导的相互作用的可能。3交泰丸催眠作用与OCTs相关性研究在确认了黄连生物碱对OCTs活性及表达存在抑制作用后,考虑到黄连为交泰丸中君药,及OCTs与中枢神经系统功能的相关性,本章实验进一步考察交泰丸催眠作用与OCTs的相关性。首先采用对氯苯丙氨酸(PCPA)建立“心肾不交”失眠大鼠模型,考察大鼠正常状态及失眠病理状态下OCTs活性的变化。通过测定探针底物二甲双胍在正常大鼠及失眠模型大鼠中药代动力学的变化,发现与大鼠正常状态相比,失眠病理状态下二甲双胍的Cmax,AUC0～t和AUC0～∞均显著减小,而CL和Vz均显著增加,t1/2无显著性变化,表明失眠病理状态可诱导肝脏OCT1或肾脏OCT2活性。随后,通过分别测定交泰丸对正常大鼠及失眠模型大鼠中二甲双胍药代动力学的变化,进一步考察了交泰丸对正常大鼠及失眠模型大鼠OCTs的调控作用。结果发现,交泰丸连续灌胃正常大鼠后,与正常空白组相比,二甲双胍的AUC0～t,AUC0～∞和t1/2显著升高,CL显著降低,Cmax呈现一定的升高趋势,Vz呈现一定的降低趋势。交泰丸连续灌胃失眠模型大鼠后,与模型空白组相比,二甲双胍的Cmax,AUC0～t,AUC0～∞和t1/2均显著升高,CL和Vz显著降低,表明交泰丸可能通过抑制失眠状态下肝脏OCT1或肾脏OCT2活性对失眠发挥作用。第三部分总结与讨论综合本课题各部分研究成果得出以下结论:(1)6种黄连生物碱对UGT活性具有显著的抑制或激活作用,并显示出明显的种属和体内外的差异,提示黄连生物碱对UGT活性的影响可能是黄连与其他药物发生代谢性相互作用的重要原因;(2)黄连生物碱对大鼠体内OCTs活性及表达均存在抑制作用,提示黄连及其生物碱与其他药物存在由OCTs介导的相互作用的可能;(3)“心肾不交”失眠病理状态可使OCTs活性发生激活样的改变,交泰丸对OCTs的抑制作用可能是其治疗失眠的重要机制,OCTs可能是交泰丸治疗失眠的重要靶点。药物与代谢酶和转运体相互作用的评价一方面有利于预防其可能带来的毒副作用,另一方面可以解释中药配伍减毒增效的机制,最终促进临床合理用药,提高药物使用的安全性和有效性。通过考察黄连生物碱对UGT及OCTs活性的抑制或诱导作用,能对黄连临床使用时潜在的药物相互作用进行早期的预测,指导合理用药;而从对OCTs抑制作用角度探讨交泰丸催眠作用机制,对揭示交泰丸作用靶标、作用机制、配伍机制及药效物质提供实验依据及指导意义。