高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI )是严重危害畜牧业和人类健康的一种传染性疾病。近年来,安徽省多次发生H5N1亚型高致病性禽流感疫情,给我省养禽业构成极大危胁。因此,寻找一种理想的免疫保护性抗原用于该病的快速诊断与免疫防治以及加强高致病性禽流感分子流行病学的研究具有重要实际意义。血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)对细胞吸附与膜融合过程中起关键作用的糖蛋白。AIV感染细胞后HA蛋白即被水解为HA1和HA2两部分,其中HA1蛋白具有与宿主细胞表面受体发生特异性结合的特性,也是HA蛋白的主要保护性抗原成分,研究HA1蛋白对揭示禽流感病毒的致病机理,研制以抗吸附作用为主的HA1疫苗具有重要的指导意义。本课题拟以H5N1亚型禽流感病毒安徽分离株A/Chicken/Anhui/M为研究对象,在对其HA1基因克隆测序和生物信息学分析的基础上,构建pET-32a-HA1和pGEX-4T-1-HA1两种重组质粒并进行原核表达。旨在从分子水平揭示安徽分离株与国内外其它分离株间的同源性,探讨HA1蛋白结构特征,表达获得大量重组HA1蛋白,为下一步制备HA1单克隆抗体、研究其功能提供物质基础,也为进一步研制HA1基因工程疫苗奠定基础。首先,采用RT-PCR方法扩增HA1基因片段,对该片段进行克隆测序和生物信息学分析。研究中我们首先根据Genbank中登录的H5N1亚型AIV HA1基因序列,设计合成一对针对HA1基因的特异性引物,以灭活的病鸡脑组织提取RNA,采用RT-PCR方法扩增HA1基因,PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-HA1,提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,筛选阳性重组克隆进行序列测定。结果显示该安徽分离株的HA1基因片段长1 038 bp,编码346个氨基酸,其N端前16个氨基酸组成信号肽,在HA切割位点处有6个碱性氨基酸序列(RRRKKR),表明该分离株为强毒株。将该安徽分离株HA1基因片段测序结果与基因库中登录的21个同一亚型禽流感病毒国内外分离株相应基因片段进行了核苷酸和推导氨基酸序列比较分析,发现该安徽分离株与其他国内外分离株间的核苷酸和氨基酸同源性均较高,分别介于96.3%～97.4%和97.0 %～97.9 %之间,尤其与河南分离株(AY741217)亲缘关系最大,提示这两个毒株可能具有相同的祖先。其次,选择不同的生物学分析软件或网络服务器,对HA1基因片段编码的氨基酸序列基本特征、蛋白的跨膜区、疏水性、信号肽、蛋白位点、抗原位点和二级结构等进行预测和分析。结果显示该蛋白由346个氨基酸组成,分子量为39.291kD,等电点(PI)为8.369,疏水性氨基酸148个,占42.78%,亲水性氨基酸143个,占41.33%。蛋白N末端的5～15aa之间含有一个跨膜区,N末端含有一个明显的疏水区,蛋白结构中含有6个N-糖基化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶II磷酸化位点和4个肉豆蔻基位点。该蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠结构为主,间或有β-转角,在蛋白的199aa -203aa、205aa -210aa、237aa -242aa、291aa -296aa、336aa -344aa之间可能存在抗原表位。最后,构建pET-32a-HA1和pGEX-4T-1-HA1两种重组质粒并进行原核表达。研究中根据测得的HA1基因序列、HA1基因编码区蛋白的结构特征以及pET-32a与pGEX -4T-1融合表达载体阅读框的要求,重新设计一对引物,扩增除去信号肽序列的HA1基因片段,将扩增后的HA1基因片断经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,分别插入经同样双酶切的融合表达载体pET-32a与pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pET-32a-HA1和pGEX-4T-HA1。将构建好的两种重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达、产物鉴定、产物定位和可溶性分析,结果显示:pET-32a-HA1/BL21(DE3)经IPTG(浓度为1mmol/L)诱导培养4小时后,Trx-HA1融合蛋白表达量达到高峰(占细菌总蛋白的44.1%);Trx-HA1融合蛋白主要是以包涵体形式表达,少量以可溶性形式表达;pGEX-4T-1-HA1/BL21(DE3)经IPTG诱导培养5小时后,GST-HA1融合蛋白表达量达到高峰(占细菌总蛋白的33.2%),GST-HA1融合蛋白完全以包涵体形式表达。Western-Blot免疫印迹分析表明两种融合蛋白均能与H5亚型HI阳性血清发生特异性反应,重组蛋白HA1 (rHA1)具有良好的抗原性。综上所述,本研究通过对HA1基因克隆测序和生物信息学分析,从分子水平揭示了H5N1亚型禽流感病毒安徽分离株与国内外其它分离株间具有高度同源性,探讨了HA1基因片段编码区蛋白的结构特征。同时,本研究中成功构建了pET-32a-HA1和pGEX-4T-1-HA1两种重组表达质粒,采用HA1基因与Trx基因或GST基因共表达方式获得了大量rHA1蛋白,为进一步制备HA1单克隆抗体、研究其生物学功能提供了物质基础,也为进一步研制HA1基因工程疫苗奠定了基础。