南极磷虾酶解产物及其亚铁复合物的制备与理化性质研究

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南极磷虾蕴藏量巨大,含有丰富的优质蛋白且氨基酸组成合理,满足FAO/WHO推荐的理想蛋白质模式。目前,我国对南极磷虾的开发、利用尚处在初级阶段,对蛋白质的利用尚不充分,易造成资源浪费。矿质元素铁对促进人体的生长发育、新陈代谢等方面具有重要的生理功能,铁缺乏可导致多种疾病。水产蛋白源螯合肽在改善矿物质缺乏症上具有潜在价值,已成为国内外学者的研究热点之一。本论文主要以南极磷虾为原料,研究制备南极磷虾酶解产物(Enzymatic Hydrolysates of Antarctic Krill,AKH)的最佳酶解工艺,并对其功能特性及抗氧化活性进行分析;在此基础上制备出南极磷虾酶解产物-亚铁复合物(Antarctic krill enzymatic hydrolysates-ferrous chelate,AKH-Fe),并对其理化性质进行探讨;建立Caco-2细胞模型评价AKH的促铁吸收效果。具体内容与结论如下:南极磷虾中含水量为(75.61±0.27)%,粗蛋白含量为(15.09±1.49)%,粗脂肪为(4.50±0.35)%,灰分为(3.47±0.13)%,总糖为(0.24±0.01)%。以亚铁螯合率为主要评价指标,水解度为辅助评价指标,从五种蛋白酶中筛选出Alcalase 2.4 L为最佳实验用酶。通过单因素实验和响应面实验确定出制备AKH的最佳酶解工艺为:酶解温度57.59℃,加酶量5.51%,pH值8.79,酶解时间300 min。在此条件下亚铁螯合率为(77.77±0.72)%,水解度为(23.22±0.16)%。AKH相对分子质量主要分布在1801000 Da之间,其比例约为89.29%。氨基酸组成分析表明AKH中Lys、Glu、Asp、Arg等特定氨基酸含量较高。体外自由基清除实验表明,AKH对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基均有良好的清除能力,且呈现较好的量效关系,其IC50分别为1.92 mg/mL、2.09 mg/mL和15.48 mg/mL。当AKH的浓度为10 mg/mL时,DPPH自由基清除率可达87.52%,羟自由基清除率为90.89%,超氧离子清除率为40.05%;但还原力相对较弱,仅为0.3391。功能特性分析显示,AKH具有较好的溶解性,当pH 6时,溶解性达到最大值(98.06±1.14)%。在60℃时,AKH持油性达到最大值,为(317.12±0.79)%。在pH 412范围内,AKH具有良好的起泡性。当pH 8时,起泡性最低,其泡沫稳定性随pH的增大先降低后升高,随后逐渐趋于平稳。在pH 210范围内,AKH乳化性呈现先升高后降低的趋势,在pH 6时,达到最大值(25.35±2.10)%,而此时的乳化稳定性最低。以前期制备的AKH为原料,以亚铁螯合率和复合物得率为指标,通过单因素实验和正交实验得到制备AKH-Fe最佳条件为:肽铁质量比3:1,螯合温度40℃,螯合时间40 min,pH 5.5,肽浓度4%,乙醇体积倍数为6。在此条件下制备的AKH-Fe的亚铁螯合率和复合物得率分别为(77.25±2.11)%和(41.03±0.68)%。紫外扫描显示,与AKH和FeCl2·4H2O相比,AKH-Fe内部原子空间结构发生了改变,价层电子跃迁不同,使其特征吸收峰的位置发生改变。傅里叶变换红外光谱扫描结果显示,Fe2+与AKH螯合后,酰胺A带发生蓝移、酰胺I带发生红移、铵盐吸收峰消失,初步说明AKH的氨基及羧基参与了螯合反应。扫描电镜结果显示AKH与Fe2+螯合后由松疏的片状结构变为颗粒状的聚集体。体外建立Caco-2细胞模型,通过跨膜电阻值和碱性磷酸酶活性评价细胞模型的完整性。实验结果表明:细胞在培养15天后,电阻值高于400Ω·cm2,此后电阻值一直维持稳定。培养21天后,AP侧的碱性磷酸酶活性是BL侧的9.64倍,Caco-2细胞已分化完全。扫描电镜和透射电镜结果显示细胞间已分化出明显的微绒毛结构与刷状缘结构,说明Caco-2细胞模型构建成功。细胞毒性实验表明,AKH对Caco-2细胞无明显毒副作用,具有良好的生物安全性。铁生物利用度实验表明,AKH具有良好地促铁吸收效果。
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