背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈逐年升高的趋势,其发病机制尚未完全阐明。CIP2A (cancerous inhibitor of protein phosphatase2A)是一种可以抑制蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase2A, PP2A)的致癌相关性蛋白。PP2A是真核生物体内丝(Ser)/苏(Thr)氨酸蛋白磷酸酶,能拮抗绝大多数丝(Ser)/苏(Thr)氨酸蛋白激酶的活性。研究发现,PP2A活性的改变或缺失与肿瘤发生有一定的相关性,目前普遍认为PP2A是一个潜在的肿瘤抑制因子。PP2A作用于致癌转录因子c-Myc的62位的丝氨酸(Ser),使其去磷酸化,从而促使c-Myc蛋白降解。CIP2A抑制了PP2A的活性,从而其可抑制癌蛋白c-Myc的降解进而维持肿瘤细胞的恶性表型,在肿瘤的发生、发展过程及生物学行为中起重要的促进作用。Reptin,又名RuvB12, Tip49b, ECP51, TAP54a, TIH2,于上世纪九十年代后期,被多家研究机构在多个物种中发现,是与多种细胞活性相关的ATP酶家族成员之一。Reptin是多种大分子蛋白复合体的组成成分,如染色体重建复合体IN080和SWR1、组蛋白乙酰基转移酶复合体Tip60等。Reptin在染色质重塑、转录调控、DNA损伤的监测与修复以及端粒酶活性中发挥重要作用。研究发现, Reptin与诸如β-连环蛋白、c-Myc、PROP1、 TLE、Hint1、NF-κB P50等转录因子或转录调节因子相互作用,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要的生物学作用。在本研究中,我们将探讨CIP2A与Reptin在肾细胞癌中的生物学作用及其临床意义。目的本研究将检测CIP2A与Reptin在肾细胞癌中的表达,分析CIP2A与Reptin表达情况与RCC患者临床病理参数及预后的关系,并通过体外细胞实验,对CIP2A与Reptin在肾癌中的生物学功能和作用机制进行初步探究和讨论。方法运用实时荧光定量PCR (realtime-PCR)检测26例肾癌组织(15例透明细胞癌,7例乳头状细胞癌,4例嫌色细胞癌)和15例癌旁肾组织及6例正常肾组织中的CIP2A mRNA的表达情况,运用免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining)检测107例肾癌组织和19例癌旁肾组织及6例正常肾组织中的CIP2A蛋白的表达情况,我们进而运用卡方检验分析了CIP2A免疫组化染色结果与肾癌患者临床病理参数相关性,并对患者进行了生存分析(survival analysis),单因素生存分析采用Kaplan-Meier曲线法,运用Log-rank检验分析其统计学意义,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards regression model)。体外细胞实验,我们选用肾癌典型细胞系A498和KRC/Y进行研究,运用特异性siRNA (small interfering RNA)将A498和KRC/Y的CIP2A的表达加以干扰,获得可靠的干扰效果之后,我们运用RT-PCR和Western-Blot检测了CIP2A及其靶向作用分子c-Myc的表达情况。运用克隆形成试验(Colony formation assay)检测了CIP2A与肾癌细胞增殖的关系；运用划痕试验(scratch migration assay)和Transwell侵袭实验(Matrigel invasion assay)检测了CIP2A与肾癌细胞迁移与侵袭的关系。运用免疫组织化学染色法(immunohistochemical staining)检测81例肾癌组织(65例透明细胞癌,10例乳头状细胞癌,6例嫌色细胞癌)和25例癌旁正常肾组织中的Reptin蛋白的表达情况。我们进而运用卡方检验分析了Reptin免疫染色结果与肾癌患者临床病理参数相关性,并对患者进行了生存分析(survival analysis),单因素生存分析采用Kaplan-Meier曲线法,运用Log-rank检验其统计学意义,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards regression model)。体外细胞实验,我们选用肾癌典型细胞系A498和KRC/Y进行研究,运用特异性siRNA (small interfering RNA)将A498和KRC/Y的Reptin的表达加以干扰,获得可靠的干扰效果之后,我们运用RT-PCR和Western-Blot检测了Reptin的表达情况。运用克隆形成实验(colony formation assay)检测各组肾癌细胞的增殖情况(proliferative capacity),运用β-Gal半乳糖苷酶染色法((3-Galactosidase staining)检测各组肾癌细胞的衰老情况(cellular senescence),运用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测肾癌细胞周期分布(cell cycle distribution),运用划痕试验(scratch migration assay)和’Transwell侵袭实验(Matrigel invasion assay)检测了Reptin与肾癌细胞迁移和侵袭的关系。结果对CIP2A的研究我们发现,实时荧光定量PCR实验结果显示:CIP2A在肾癌组织中的表达(89.58±11.81)较之癌旁肾组织(5.27±0.56)及正常肾组织(3.67±0.92)明显升高(P<0.001),在肾透明细胞癌(130.67±11.48)中的表达明显高于乳头状癌(36.14±7.71),亦高于嫌色细胞癌(29.00±6.06)(P<0.001)。免疫组织化学染色实验结果显示：在107例肾癌组织中,有75例CIP2A过度表达(70%),而在19例癌旁肾组织中有6例(32%),在6例正常肾组织中有1例(17%)存在CIP2A的微弱表达(P<0.001),CIP2A的表达主要分布在细胞质,细胞核中偶有表达。CIP2A免疫染色强度与肾癌患者的病理分期(P<0.001)、组织学分级(P=0.004)、临床分期(P<0.001)、淋巴转移(P<0.001)、远处转移(P<0.001)与病理类型(P=0.022)密切相关,与患者的性别(P=0.125)和年龄(P=0.082)不相关。生存分析显示,CIP2A的过度表达预示着肾癌患者较差的预后,多因素分析表明,CIP2A的高表达是肾癌患者独立的预后因子,这一点在透明细胞癌患者中尤为突出。体外细胞实验显示,运用特异性siRNA干扰肾癌细胞系A498和KRC/Y的CIP2A表达之后,c-Myc的表达同时也被下调。克隆形成实验结果显示,干扰CIP2A之后两种细胞系肿瘤细胞的增殖能力未受到明显抑制；细胞划痕试验结果显示,干扰CIP2A之后两种细胞系肿瘤细胞的迁移能力均受到明显抑制(细胞迁移距离,划痕后24小时A498空白对照组vs CIP2A干扰组：100±11vs16±2,P<0.001;KRC/Y空白对照组vs CIP2A干扰组：117±15vs16±2,P<0.001；划痕后48小时A498空白对照组vs CIP2A干扰组：235±5vs28±3,P<0.001;KRC/Y空白对照组vs CIP2A干扰组：230±5vs47±8,P<0.001);细胞Transwell侵袭实验结果表明,干扰CIP2A均可抑制两种细胞系肿瘤细胞的侵袭能力(细胞侵袭计数,A498空白对照组vs CIP2A干扰组：115±5vs24±2,P<0.001;KRC/Y空白对照组vs CIP2A干扰组：71±4vs12±3,P<0.001)。对Reptin的研究发现,免疫组化染色结果显示：在81例肾癌组织中,有56例Reptin过度表达(69.1%),而在25例癌旁正常肾组织中有6例(24.0%)存在较弱的散在的Reptin表达(P<0.001),肾癌组织中Reptin的表达既分布在细胞质又分布在细胞核,Reptin免疫染色强度与肾癌患者的病理分期(P=0.020)和组织学分级(P=0.040)密切相关,与患者的性别(P=0.172)、年龄(P=0.779)、淋巴转移(P=0.892)、远处转移(P=0.434)、临床分期(P=0.139)与病理类型(P=0.499)不相关。另外,Reptin在肾癌细胞中的表达定位与肿瘤的组织学分级密切相关,存在细胞质表达的肾癌患者其肿瘤分化较差,而仅有细胞核表达的相对分化较好(P=0.001)。生存分析显示,高病理分期(P<0.001)、存在远处转移(P<0.001)及低分化(P=0.004)肾癌患者预后较差,Reptin表达与否与肾癌患者的预后没有明显的相关性(P=0.176),但是有Reptin定位于细胞质的肾癌患者,较之仅定位于细胞核和无Reptin表达的患者预后为差(P=0.001)。多因素分析表明,Reptin在肾癌细胞的细胞质表达是肾癌患者独立的预后因子(P=0.048)。体外细胞实验,运用特异性siRNA干扰肾癌细胞系A498和KRC/Y的Reptin表达之后,克隆形成实验结果显示,肾癌细胞的增殖能力明显受限(克隆形成计数：A498空白对照组vs Reptin干扰组：69±4vs13±2, P<0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：46±3vs3±0.5, P<0.001), β-Gal染色实验显示,干扰Reptin可以导致肿瘤细胞衰老(β-Gal阳性染色细胞百分比：A498空白对照组vs Reptin干扰组：6.1+0.6vs51.8±3.8, P<0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：3.6±0.4vs36.7±1.8, P<0.001),流式细胞术细胞周期分析显示,干扰Reptin可以导致肿瘤细胞周期停滞在G1期(G1期肿瘤细胞百分比：A498空白对照组vs Reptin干扰组：46.2+2.0vs56.8±1.3, P<0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：51.5±0.5vs66.3±0.7, P<0.001),细胞划痕试验结果显示,肿瘤细胞的迁移能力受到抑制(细胞迁移距离：划痕后24小时A498空白对照组vs Reptin干扰组：182±6vs149±9, P <0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：80±10vs12±3, P<0.001;划痕后48小时A498空白对照组vs Reptin干扰组：229±6vs180±8, P<0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：188+10vs24+6,P<0.001),细胞Transwell侵袭实验结果显示,肿瘤细胞的侵袭能力受到抑制(侵袭细胞计数：A498空白对照组vs Reptin干扰组：96±7vs20±2, P<0.001; KRC/Y空白对照组vs Reptin干扰组：100±4vs32±3,P<0.0001)。结论CIP2A在肾细胞癌中高表达,在肾透明细胞癌中尤为突出,其高表达可能与肾癌的侵袭和转移密切相关,与肿瘤的恶性程度正相关,并预示着肾癌患者较差的预后,是影响肾癌患者预后的独立因子,CIP2A或许可以作为治疗肾癌及预防肾癌转移和复发的一个靶向因子；Reptin在肾癌中过度表达并且存在异常分布现象,Reptin在肾癌细胞质中表达与肾癌的低分化有关,并预示着肾癌患者较差的预后,是影响肾癌患者预后的独立因子。Reptin在肾癌细胞增殖与逃逸衰老中发挥重要作用,干扰Reptin可以损害肾癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力,并可直接诱导肾癌细胞的衰老。因此,Reptin有可能作为治疗肾癌的有效靶点。