第一章文献综述本章较为系统的归纳整理了地黄叶的本草考证及地黄和地黄叶中主要资源性化学成分,综述了地黄叶的药理活性及临床应用,为地黄叶这一资源的合理开发和利用提供科学依据。同时归纳和总结了糖尿病肾病的发病机制研究进展,高糖通过参与氧化应激和增加晚期糖基化终末产物的产生以及肾素-血管紧张素系统和蛋白激酶C的激活等多种机制引起血管炎症并改变生长因子和细胞因子的基因表达,从而可能参与糖尿病肾病的发生和发展。第二章地黄叶资源化学研究与评价一、地黄样品的采集与处理本实验选取河南省武陟县大封镇的新鲜地黄用于分析不同生长期地黄根与叶中资源性化学成分动态变化与积累。并分别选取河南省武陟县大封镇(河南大封)、河南省南阳市南召县(河南南召)与河南省焦作市温县(河南温县)三个产地的新鲜地黄叶样品用于分析评价不同产地地黄叶中资源性化学成分的动态积累。本实验地黄均为采摘的新鲜地黄样品,经45℃烘干后,粉碎过40目筛,备用。二、地黄叶各类资源性化学成分分析与评价1.通过选取不同生长期地黄根与叶及不同产地地黄叶为研究对象,采用UPLC-TQ/MS联用技术,分析评价地黄根与叶中梓醇、毛蕊花糖苷及益母草苷的动态积累变化。结果显示,8月中旬即地黄生长旺盛期此3种苷类成分含量较高,且地黄叶中梓醇、毛蕊花糖苷和益母草苷含量均明显高于相应时期地黄根中含量,其中梓醇含量最高,达23.76 mg·g-1。不同产地成分分析结果表明,来自河南大封、河南温县、河南南召三个产地中各生长期地黄叶中3种苷类成分含量无明显差异,且在9月中旬含量较高。因此,地黄叶中同样含有较高含量的梓醇、毛蕊花糖苷和益母草苷成分,且其可作为获取此3种苷类成分的资源原料。2.通过紫外-可见分光光度法与HPLC-ELSD法分别评价了不同生长期地黄不同部位及不同产地地黄叶中多糖与单/寡糖类资源性化学成分的积累,分析地黄根与地黄叶的单/寡糖与多糖含量。研究结果表明,8月中旬即地黄生长旺盛期地黄叶与根中单/寡糖类成分含量最高。已检测出地黄叶中单糖类主要含有鼠李糖,寡糖类主要含有果糖、蔗糖、水苏糖和毛蕊花糖,其中鼠李糖含量较高;地黄根中单糖类主要含有鼠李糖,寡糖类主要含有果糖、蔗糖、蜜二糖、水苏糖和毛蕊花糖。不同产地研究结果表明,来自河南大封、河南温县、河南南召三个产地中各生长期地黄叶中河南大封地黄叶中单/寡糖类成分含量较高。多糖研究结果表明,地黄叶中含有较高含量的多糖类成分。3.通过建立UPLC-TQ/MS法对不同生长期地黄不同部位及不同产地地黄叶中核苷类成分及氨基酸类成分进行分析。结果表明,地黄及地黄叶中均含有4种核苷类成分和15种氨基酸类成分。在6月中旬至8月中旬和10月下旬地黄叶中核苷类和氨基酸类成分总含量均高于地黄根中成分含量,其中L-谷氨酰胺与L-赖氨酸含量最高,分别达9.956 mg.g-g和5.598mg·g-1。且来自河南大封、河南温县、河南南召三个产地各生长期地黄叶中以河南温县产者含量较高,总含量最高可达30.756 mg·g-1。第三章地黄叶总苷对糖尿病肾病大鼠肾损伤的改善作用及机制研究一、地黄叶总苷对糖尿病肾病大鼠药效作用评价研究本节通过STZ加5%葡萄糖水诱导建立糖尿病肾病大鼠模型,测定空腹血糖、血肌酐、尿素氮及尿蛋白指标确定模型建立成功,即模型大鼠出现肾小球滤过功能障碍。以地黄叶总苷提取物(DHY)及地黄叶总苷胶囊(JN)给药两周后,收集血清、尿液及肾脏样本,分别进行生化指标测定、肾组织病理学分析及Western blotting法分析肾组织中Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β1的蛋白表达。结果表明,地黄叶总苷给药后能显著降低尿蛋白、血肌酐和尿素氮的水平,改善空腹血糖及血脂水平,减轻肾间质纤维化程度,降低Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β1蛋白的表达水平,从而发挥肾脏保护作用。二、基于代谢组学研究地黄叶总苷对糖尿病肾病大鼠的干预作用本节基于代谢组学研究地黄叶总苷对糖尿病肾病的干预作用,对大鼠血清及尿液样本进行分析,鉴定出27种内源性代谢物(血清12种,尿液15种),并由此构建出5条相关代谢通路,即鞘脂代谢(影响值0.31)、戊糖和葡萄糖醛酸相互作用(影响值0.27)、萜类骨架生物合成(影响值0.21)、嘌呤代谢(影响值0.15)和视黄醇新陈代谢(影响值0.15)。药物干预后,这些标志物有一定程度的回调(P<0.05)。从代谢方面验证了地黄叶总苷对由STZ诱导的糖尿病肾病大鼠有较好的改善作用。三、毛蕊花糖苷在正常与糖尿病肾病大鼠体内药动学研究本节建立了 UPLC-TQ-MS法分析评价地黄叶总苷提取物和地黄叶总苷胶囊中毛蕊花糖苷在正常及糖尿病肾病模型大鼠体内的药动学参数。结果表明,毛蕊花糖苷在8.51～3404.76ng·mL-1,r2=0.9987范围内线性关系良好,提取回收率在63.55～79.49%,日内、日间精密度均<8.8%。与空白组相比较,糖尿病肾病模型组大鼠相应给药组Cnax与AUC0-t显著降低,且药物清除率增加。地黄叶总苷提取物及地黄叶总苷胶囊给药后,毛蕊花糖昔均在15分钟左右达到最大血药浓度。该方法简便且快速,并适用于糖尿病肾病大鼠血浆中毛蕊花糖苷的药代动力学研究。四、地黄叶总苷对糖尿病肾病大鼠肠道菌群的调节作用研究本节通过16S rDNA测序的方法研究评价地黄叶总苷提取物和地黄叶总苷胶囊对糖尿病肾病大鼠肠道菌群多样性的调节作用。研究发现,与空白组相比,糖尿病肾病模型组大鼠肠道菌群从门分类水平到属分类水平均发生了变化;在科及属分类的菌群中,双歧杆菌属、传代菌属、消化链球菌科、脱硫弧菌属、SMB53在模型组呈现上调趋势,乳酸杆菌属、梭菌属、理研菌科、瘤胃菌科在模型组呈现下调趋势,且各组药物能不同程度的改善以上肠道菌群在模型组中的相对丰度。可见,地黄叶总苷具有改善STZ诱导的糖尿病肾病大鼠肠道菌群失调的作用。五、基于Wnt/β-catenin信号通路及TGF-β1的地黄叶总苷对高糖诱导的肾小球系膜细胞的作用机制研究Wnt/β-catenin信号通路及TGF-β1是肾纤维化发病机制中的关键性因子。本节基于整体动物体内研究结果,建立了高糖诱导的肾小球系膜细胞(GMCs)模型,进一步研究地黄叶总苷及其主要成分毛蕊花糖苷的肾脏保护作用。研究结果表明,地黄叶总苷和毛蕊花糖苷可促进高糖条件下GMCs的增殖,降低在高糖培养条件下的GMCs中Wnt4、β-catenin、TGF-β1的蛋白表达,提示地黄叶总苷和毛蕊花糖苷对GMCs纤维化形成的抑制作用,且与整体动物研究结果相一致,进一步证实了地黄叶总苷和毛蕊花糖苷可通过调控Wnt/β-catenin信号通路与TGF-β1蛋白水平,发挥其肾脏保护作用。第四章地黄叶总苷对db/db小鼠早期肾脏损伤的改善作用及机制研究一、地黄叶总苷对db/db小鼠早期肾脏损伤的改善作用评价研究本节以自发型糖尿病db/db小鼠为实验动物模型,应用地黄叶总苷进行干预治疗,对其各项生化指标、肾脏病理切片分析以及利用Western blotting法分析TGF-β/smad信号通路。生化指标分析结果显示,与模型组比较,血肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白水平在治疗组明显改善,且血脂水平(总胆固醇和甘油三酯)及空腹血糖与血胰岛素水平在给药组中也有不同程度的改善。另外,肝脏指标(谷草转氨酶和谷丙转氨酶)含量在模型组显著增加,可见高糖引起了肝脏损伤,且地黄叶总苷和毛蕊花糖苷可改善高糖引起的肝脏损伤。Western blotting实验结果显示,肾脏组织中TGF-β1及其信号转导蛋白Smad3和Smad4与α-SMA蛋白表达在给药组中显著下降,尤其是地黄叶总苷提取物作用最为显著。二、地黄叶总若对db/db小鼠肠道菌群多样性的调节作用研究本节应用16S rDNA基因测序技术,评估地黄叶总苷对db/db小鼠肠道菌群多样性的调节作用。研究发现,与空白组db/m小鼠相比,模型组db/db小鼠在门分类水平到属分类水平均发生显著性差异。其中与空白组相比,模型组db/db小鼠拟杆菌门、拟杆菌目S24-7、Acetatifactor相对丰度显著增加;厚壁菌门、软壁菌门、毛螺菌科NK4A136、Lachnoclostridium、统微菌科UCG-004、柔膜菌纲RF9、消化球菌属、Tyzzerella、毛螺菌科、罗氏菌属、Ruminiclostridium、韦荣球菌科相对丰度显著降低。结果表明,db/db小鼠体内发生了一定程度的肠道菌群失调。而给药组(除Ruminococcaceae_UCG-004)可在一定程度上改善肠道菌群失衡,说明地黄叶总苷对db/db小鼠的肾脏保护作用可能涉及其对肠道菌群的调节作用。三、基于代谢组学研究地黄叶总苷对db/db小鼠的干预作用本节基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学技术对db/db小鼠血清中潜在的差异性内源性代谢产物进行分析,并分析其相关代谢通路。鉴定出13种内源性代谢物,并由此推断出4条相关代谢通路,即醚脂类代谢(影响值0.36)、鞘脂类代谢(影响值0.28)、乙醛酸和二羧酸代谢(影响值0.13)和花生四烯酸代谢(影响值0.1)。结果表明药物干预后,这些标志物有一定程度的回调(P<0.05)。该研究进一步探索了地黄叶总苷对db/db小鼠早期肾脏损伤的保护作用机制。四、地黄叶总苷对高糖诱导的HK-2细胞TGF-β/smad信号通路的调节作用机制研究本节实验选择人肾小管上皮(HK-2)细胞,建立体外高糖诱导的HK-2细胞损伤模型,用地黄叶总苷胶囊、地黄叶总苷提取物及其中主要活性成分毛蕊花糖苷与梓醇进行干预,采用Western blotting法及Real time-PCR法检测各细胞中相关蛋白及mRNA的表达量;采用ELISA法检测细胞上清液中相关因子的分泌情况。研究结果揭示地黄叶总苷可促进高糖条件下HK-2的增殖和且对EMT形成的抑制作用,且与整体动物研究结果相一致,进一步证实了地黄叶总昔及毛蕊花糖苷、梓醇可通过调控TGF-β/smad信号通路发挥其肾脏保护作用。