论文部分内容阅读
戊型肝炎（Hepatitis E, HE）是一种由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）引起的急性病毒性肝炎。HEV主要经消化道，以粪口途径为最主要的传播方式。HEV既可以在一些公共卫生条件较差的不发达国家引起大规模的暴发流行，也可以在发达国家引起急性散发性发疾病，我国是HE的主要流行区之一。HEV属于肝炎病毒属，为无囊膜，单股正链RNA病毒，其基因组全长约为7.2Kb，比禽HEV基因组全长多600bp左右，含有3个开放阅读框（Open reading frame，ORF），分别为ORF1、ORF2和ORF3。其中ORF2编码衣壳蛋白是病毒的主要结构蛋白，并且包含病毒主要的抗原表位。本文通过原核表达禽和猪HEV的衣壳蛋白，了解该蛋白的抗原性，从而为该病毒的诊断和预防等提供材料和理论支持。1.禽HEV衣壳蛋白抗原性分析以中国禽HEV（GenBank accession NO. GU954430）分离株的病毒悬液为模板，设计引物原核表达衣壳蛋白N端ORF2-A（23-358aa）和C端ORF2-B（339-606aa）蛋白。通过免疫BALB/c小鼠，在免疫方法、免疫剂量和检测方法均相同的情况下，免疫ORF2-A蛋白的小鼠五免后抗体水平勉强等同于免疫ORF2-B蛋白的小鼠三免后的抗体水平；同时，在对收集的1379份来自不同地区临床鸡血清的检测中，发现502份（36.4%）临床血清含ORF2-B抗体，仅331（24%）临床血清针对ORF2-A抗体阳性，其中143份（10.4%）份含ORF2-A抗体而不含ORF2-B抗体。上述实验结果表明，禽HEV衣壳蛋白的C端和N端区域的抗原性存在明显差异，并且其C端区域的免疫反应原性强于其N端区域。随后利用抗原性分析软件DNAStar将ORF2-A蛋白分为相互重叠的4段区域，然后原核表达，利用分段的蛋白检测免疫小鼠血清和临床ORF2-A抗体阳性鸡血清，结果分析发现衣壳蛋白的N-端区域的主要抗原区位于23-84aa之间。2.猪HEV衣壳蛋白C端区域单克隆抗体的制备及鉴定以山东省猪HEV分离株的病毒悬液为模板，设计引物获得与禽HEV的ORF2-B蛋白对应的基因序列，并进行原核表达获得蛋白（ORF2-S）。蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠，经常规的细胞融合和亚克隆制备出3株特异性针对猪HEV ORF2-S蛋白的单克隆抗体（1E4，2C7，2G9）。单抗与临床收集的猪血清竞争ELISA发现，1E4和2G9能够阻断临床阳性猪血清，提示该两株单克隆抗体识别的抗原表位是猪HEV衣壳蛋白上重要的抗原表位区，而单抗Mab-2C7不能阻断。衣壳蛋白单克隆抗体的制备为猪HEV的诊断及研究提供重要工具。3.禽与猪HEV衣壳蛋白共有抗原表位分析利用制备的6株抗禽HEV衣壳蛋白的单抗以及3株抗猪HEV衣壳蛋白的单抗分别与禽、猪HEV衣壳蛋白进行交叉反应，发现抗禽HEV的单抗1B5与3E8识别的表位为禽、猪HEV所共有，其共有抗原表位位于禽HEV衣壳蛋白C端335-383aa之间。本研究通过分析禽、猪HEV衣壳蛋白的抗原性，对禽与猪HEV的血清学检测具有指导作用；制备的针对猪HEV的单抗可以应用于病毒的检测；同时鉴定了一个禽、猪HEV共有抗原表位，对于研究HEV的抗原性具有重要意义。