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关节软骨在关节正常生理活动中发挥着重要作用,一旦损伤就难以修复。目前组织工程技术是新兴的用于治疗软骨损伤的手段,3D生物打印技术可应用于组织工程中,非常适合修复关节软骨及软骨下骨界面的缺损。软骨组织工程的关键在于种子细胞与支架材料的选择。本课题旨在探讨以软骨祖细胞（Chondroprogenitor Cells,CPCs）作为种子细胞,利用3D生物打印技术将其包封于甲基丙烯酰化明胶（methacrylated gelatin,GelMA）/甲基丙烯酰化海藻酸盐（methacrylated alginate,AlgMA）水凝胶支架中修复软骨缺损的可行性与有效性,为临床修复软骨缺损提供新的治疗策略。第一部分 小鼠软骨祖细胞及骨髓间充质干细胞的分离和鉴定目的:从小鼠软骨和骨髓中分离培养CPCs以及骨髓间充质干细胞（Bone-marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）,评估比较两种细胞增殖及三系分化能力,检测细胞表面标志物表达谱,为软骨组织工程筛选出合适的种子细胞。方法:（1）CPCs:无菌条件从5天龄、雄性C57BL/6小鼠肩关节、膝关节和股骨头中获得软骨组织,以Ⅱ型胶原酶消化后获得细胞悬液。采用纤连蛋白黏附分选法获得小鼠CPCs;BMSCs:无菌条件下获得6周龄、雄性C57BL/6小鼠胫骨和股骨骨髓液,用全骨髓贴壁法获得小鼠BMSCs;（2）克隆形成率实验和CCK-8实验评估增殖能力;（3）三系诱导评估细胞间质三系分化潜能;（4）流式细胞术检测细胞表面标志物表达情况。结果:（1）纤连蛋白分选出的CPCs同BMSCs一样,符合间充质干细胞的基本特征,即具有塑性黏附和克隆形成能力,表达特定的间充质干细胞表面标志物（CD29、CD90）,不表达造血细胞的表面标志物（CD34、CD45）,具有成骨、成脂及成软骨分化潜能;（2）CPCs的成软骨分化潜能要优于BMSCs,而增殖潜能、成骨和成脂分化潜能则不如BMSCs。结论:来源于关节软骨的CPCs具有间充质干细胞的共性并保留了一些软骨组织的特性,可作为软骨修复组织工程的种子细胞。第二部分 3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶复合CPCs与BMSCs的体外成软骨分化能力研究目的:评价3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶复合CPCs与BMSCs的可行性,体外探讨其成软骨分化能力。方法:以CPCs和BMSCs为种子细胞,利用3D生物打印技术制作复合细胞的GelMA/AlgMA水凝胶支架。（1）扫描电子显微镜观察水凝胶支架的微观结构;（2）测定溶胀率和降解曲线,表征水凝胶支架的溶胀性能和降解性能;（3）细胞活死染色实验评价水凝胶的生物相容性;（4）体外成软骨诱导观察细胞增殖、糖胺聚糖生成情况,行qRT-PCR测定软骨相关基因和软骨肥大基因mRNA表达。结果:（1）扫描电镜观察结果显示水凝胶支架表面呈蜂窝状多孔结构,有利于细胞的黏附;溶胀和降解实验表明该水凝胶支架具有良好的吸水性和降解性能;（2）3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶支架中CPCs和BMSCs存活状态良好,在第1天和第7天存活率都在80%左右,表明3D生物打印过程并不会对细胞的存活状态造成太大影响,且该水凝胶材料具有良好的生物相容性;（3）体外成软骨诱导一定时间后,DNA含量和sGAG含量明显增加,且GelMA/AlgMA+CPC组软骨相关基因表达明显升高,明显高于GelMA/AlgMA+BMSC组,而纤维化软骨基因CPC组则要低于BMSC组。结论:3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶支架形态良好,负载于其中的细胞存活、增殖及成软骨分化能力状态良好。GelMA/AlgMA+CPC组的成软骨分化能力优于GelMA/AlgMA+BMSC 组。第三部分 3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶复合CPCs与BMSCs体内修复软骨缺损研究目的:研究3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶复合CPCs与BMSCs体内修复兔关节全层软骨缺损的效果。方法:以兔CPCs和BMSCs为种子细胞,以GelMA/AlgMA为支架材料,利用3D生物打印技术制造负载细胞的支架,并植入兔关节软骨缺损处。分为四组:（1）空白组;（2）单纯3D打印GelMA/AlgMA水凝胶组;（3）3D生物打印负载CPCs的GelMA/AlgMA水凝胶组;（4）3D生物打印负载BMSCs的GelMA/AlgMA水凝胶组。术后第6周和12周分别取出软骨缺损处标本,Micro-CT扫描后,行HE、番红O-快绿染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果:术后实验兔伤口愈合良好,无感染化脓现象。移植6周后,空白组关节软骨缺损被纤维组织覆盖,GelMA/AlgMA支架组缺损表面还残留较大的的裂缝。GelMA/AlgMA+CPC水凝胶支架组缺损处大部分已愈合。移植12周后空白组的关节缺损填充仍大部分被纤维组织所替代,有少量软骨样组织在缺损边缘生成;在GelMA/AlgMA支架组,关节表面有所愈合,但是呈纤维组织和纤维软骨混合修复;GelMA/AlgMA+BMSC水凝胶支架组和GelMA/AlgMA+CPC水凝胶支架组两组呈纤维软骨和软骨样组织混合修复,有区别的地方在于GelMA/AlgMA+BMSC水凝胶支架组缺损修复填充区表面未愈合完成,有大量软骨下骨新骨生成,GelMA/AlgMA+CPC水凝胶支架组在缺损部位修复组织大部分为透明软骨样组织,细胞外基质成分Ⅱ型胶原免疫组化染色强烈。结论:3D生物打印GelMA/AlgMA水凝胶支架能够与缺损处周围的软骨组织整合,并促进软骨细胞的播散和增殖,以及软骨细胞外基质沉积。采用3D生物打印负载CPCs的GelMA/AlgMA水凝胶支架能修复软骨缺损,在软骨缺损修复方面具有较好的应用前景。