缺氧对人牙髓细胞线粒体及miR-210-3p表达的影响

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细胞缺氧在心脑血管疾病和癌症中较为常见的细胞状态,细胞缺氧应答反应是由多因子多通路调控的。不同细胞对于缺氧的耐受程度均有明显差异。探究缺氧状态下细胞相关调节机制,将指导人们通过相关机制的调节作用来降低缺氧对细胞造成的损害,进而抑制细胞凋亡,促进细胞的再生与修复。人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)是由牙髓组织中分离出来的,由于牙髓组织被坚硬的牙本质包绕,氧气到达牙髓组织需要通过走行于狭窄根管内的血管,缺乏有效的侧支循环,这就造成牙髓组织内氧浓度要远远低于正常环境中的氧分压。这说明人牙髓细胞适应于低氧环境,并对缺氧有一定的耐受作用。对细胞缺氧尤为敏感的细胞器之一就是线粒体,作为细胞呼吸和能量供应的主要场所,缺氧会导致线粒体的形态结构发生适应性以至于病理性的改变。而miR-210作为缺氧特异性miRNA,可分为miR-210-3p和miR-210-5p。它在细胞缺氧后会对细胞产生保护作用,抑制线粒体呼吸以及细胞凋亡等。MiR-210在缺氧性心脑血管疾病以及肿瘤等领域已经得到了广泛研究,但在人牙髓细胞缺氧后miR-210的调节作用以及相关研究却少见报道。目的:探究缺氧状态下人牙髓细胞线粒体形态功能的改变,观察线粒体缺氧后超微结构变化,并进一步探讨mi R-210在缺氧状态下对人牙髓细胞的调控作用。方法:采用组织块酶消化法体外培养人牙髓细胞,取接种好的第5代细胞分别置于厌氧罐(5%CO2、95%N2)和5%CO2恒温培养箱中(5%CO2、21%O2)培养6h、12h、18h、24h后,利用罗丹明123染色,流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位;取接种好的第5代细胞分为常氧组:5%CO2恒温培养箱中(5%CO2、21%O2)培养24h;缺氧组:厌氧罐(5%CO2、95%N2)分别培养6h、12h、18h、24h,进行固定、染色、切片,利用透射电镜观察细胞线粒体超微结构的改变;取接种好的第5代细胞分别置于厌氧罐(5%CO2、95%N2)和5%CO2恒温培养箱中(5%CO2、21%O2)培养6h、12h、18h、24h后,利用real-time PCR检测细胞miR-210的表达。结果:1、采用组织块酶消化法成功获取人牙髓细胞。恒温培养箱中培养35天后显微镜下观察可见组织块周围有细胞游出,亦可见被酶消化成的单个细胞或细胞群贴壁生长。细胞呈长梭形,有突起,似成纤维细胞形态;传代后细胞在24h之内可顺利贴壁,且贴壁后细胞生长状态良好,增值速度较快,平均35天可传代一次。传代后细胞呈长梭形,有突起,细胞排列呈放射状或漩涡状。2、利用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的结果显示:常氧组的细胞随着时间的延长,线粒体膜电位略有升高,缺氧组随着缺氧时间的延长,线粒体膜电位呈明显降低的趋势(P<0.01),且每个时间段缺氧组细胞线粒体膜电位均明显低于常氧组(P<0.01)。3、透射电镜结果显示:常氧组细胞膜结构完整,胞质中细胞器丰富,核膜完整,线粒体大小及数量正常。线粒体膜结构完整,嵴清晰,嵴排列与线粒体长轴垂直。核膜可见清晰双层膜结构;缺氧6h组细胞膜结构完整,线粒体数量较常氧组增多,线粒体结构均完整,可见肥大线粒体;缺氧12h组细胞胞质内出现空泡样改变,线粒体出现多种病理形态改变:肿胀、变形、破裂、嵴崩解、空泡样变、出现纵向嵴线粒体(即嵴与线粒体长轴平行)、线粒体形成髓鞘样结构等。缺氧18h组细胞胞质内空泡增多,亦可见多种病理变化,线粒体破裂较12h增多;缺氧24h胞质出现大量空泡,染色质边集,核膜破裂等。4、缺氧组miR-210-3p的表达在6h后有明显上升趋势,但24h表达下降;常氧组miR-210-3p表达量未见明显变化;各时间段缺氧组与常氧组相比,其表达量均明显升高,并有统计学意义(P<0.01)。结论:1、缺氧时间延长,人牙髓细胞线粒体膜电位下降;细胞损伤加重;miR-210-3p表达上调,这与细胞损伤程度呈正相关。2、miR-210-3p与人牙髓细胞缺氧密切相关,可能参与了细胞的凋亡过程。
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