研究背景TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体),现已证实该细胞因子参与调控心血管疾病,代谢性疾病及自身免疫性疾病等的病理生理过程。人体内的TRAIL是一种含有281个氨基酸(小鼠的有291个氨基酸)的Ⅱ型跨膜蛋白。作为一种跨膜蛋白,TRAIL在细胞表面被半胱氨酸蛋白酶进一步裂解,形成了可溶性的TRAIL(又被称为sTRAIL)。可溶性的TRAIL保留了整个分子结构域的生物学效应。在脂肪细胞中,TRAIL阻断了胰岛素刺激的血糖摄取和脂质的新生,由凋亡依赖的PPARy降解产生作用,但与胰岛素信号的改变和NF-κB的激活无关。众多研究表明,人体中TRAIL的含量与代谢紊乱有一定的相关性。高血脂是动脉粥样硬化的首要危险因素,并且升高的血脂和血管炎症之间的密切关系突出了动脉粥样硬化成因中脂质代谢受损的重要性。在动脉粥样硬化斑块形成的过程中,巨噬细胞迁移到皮下间隙,吞噬低密度脂蛋白胆固醇,导致承载胆固醇的泡沫细胞的形成和集聚。这一过程标志着一个主要的动脉粥样硬化病变形成的最初始的病理生理反应。作为一种能够引发心脑血管疾病的危险因素之一,高脂血症的存在越来越引起人们的重视。所谓的高脂血症,主要是由于脂质代谢异常而导致血清中一种或者多种脂质指标高于正常生化参数的现象。主要表现为血清总胆固醇(total cholesterol, TC),甘油三酯(Triglycerides, TG),低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)高于正常水平和(或)高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteincholesterol, HDL-C)低于正常水平。该疾病多在中老年人群中出现。但是,伴随着生活压力的增加、饮食营养状况的改善以及吸烟饮酒的增多,高脂血症的患病率呈现一种逐渐增高的趋势,并出现了该疾病越来越年轻化的现象。在祖国传统中医学中,我们往往将高脂血症归类于古籍文献中的“痰浊”、“痰湿”、“眩晕”、“痰饮”等病。在其成因方面,传统中医学理论认为其与饮食不节关系紧密。饮食不节,中医上主要是指过食肥甘厚味等。《内外伤辨·饮食劳倦论》中已经明确有记载：“饮食失节,寒湿不适,则脾胃乃伤”。《本草经疏》中也有记载：“饮啖过度,好食油面猪脂,浓厚胶固,以致脾气不利,壅滞为患,皆痰所为”。经典名著《素问·痹论》中对饮食不节的描述是“饮食自倍,脾胃乃伤”。强调了脾胃乃后天之本,主运化饮食水谷,将水谷精微化为营血津液,输行一身。而过食膏脂,损伤脾胃,助湿生痰,血流不畅,不随气行,脾气不利,壅滞为患。在脉中,则为痰浊淤血,搏结脉道。上述病因病机的出现导致了高脂血症这一疾病的产生。许多研究证实TRAIL可能在肥胖,糖尿病和高脂血症等代谢性疾病的发病机制中发挥着重要的作用。在由33名家族性高胆固醇血症患者和10名健康人组成的小范围的调查中,Holven等人发现家族性高胆固醇血症患者外周血单个核细胞中TRAIL的表达高于正常健康人群,并且这种改变与TNF-α受体、CD40等其他炎症指标表达的升高是同步的,暗示了其具有一种促炎症的作用。并且,该研究还发现在高胆固醇血症患者中TNF-α的基础含量和应激含量也都有相应的提高。Brombo等人也有相似的研究,他们发现人体血清中TRAIL浓度与总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯呈现一种正相关性,而与高密度脂蛋白胆固醇表现出一种负相关性,同时他们还发现,在排除其他因素后,TRAIL和低密度脂蛋白胆固醇之间的相关性依然是有意义的有研究发现,身体肥胖指数越高的人,其体内的sTRAIL的含量也越高。另外,Choi等人在一项健康的绝经后妇女的调查研究中发现,在较高区域的血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)中,血清sTRAIL浓度显著升高。但是,有的研究中在另外一项关于代谢综合征患者的研究中,作者发现在较低或者较高sTRAIL浓度下TC或者LDL-C并不存在明显的个体差异。既往对人体内TRAIL水平的研究多数以白种人或者非亚洲人为主,且在我国人群中尚未有sTRAIL水平和高胆固醇血症之间的关系的相关研究。基于此,我们认为十分有必要对sTRAIL和高脂血症之间的关系进行进一步的研究和阐明,以期逐步了解TRAIL水平在我国人群中的分布情况。以确定sTRAIL是否随着血脂的不同而有所改变,以期为我国人群中sTRAIL水平和高胆固醇血症之间的关系提供更多的证据,对进一步探讨TRAIL在人类动脉粥样硬化的发病机制中的作用,具有十分重要的临床意义。研究目的对352例纳入者体内生化参数及sTRAIL水平的测量及分析,观察我国汉族人群中血清sTRAIL浓度与总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇等血脂水平之间的相关性,并将相关血脂参数的高低进行分区,观察各区域之间是否存在差异性,以便进一步了解高脂血症人群中sTRAIL的水平。研究方法1.病例选择本临床研究病例均来自医院健康体检中心。纳入者在健康体检中心在完成常规的个人注册并剔除特定的疾病的检查。排除了糖尿病、自身免疫性疾病、炎症性疾病、冠心病以及年龄和性别等其他条件的限制。2.血清样本生化测量和数据收集血生化样本的测量主要为总胆固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C。其他生理学数据主要来自健康体检纳入者本人的健康体检报告。3. sTRAIL水平的测定使用静脉采血针抽取健康体检纳入者隔夜空腹静脉血0.5ml。室温离心后取上层血清。血清样本存于-80℃冰箱以备使用。sTRAIL血清浓度测量主要采用了不同供应商供应的ELISA试剂盒。严格按照试剂盒的相关说明书进行sTRAIL浓度的检测。4.统计学分析定量数据均以均数±标准差表示,数据分析使用GraphPad Prism软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验；斯皮尔曼相关性分析主要用于检测两组参数之间的相关性。设P<0.05为具有统计学意义。分类数据进行卡方检验。所有数据检验均为双向的。研究结果1.健康体检纳入者的基本情况392例健康体检者符合纳入标准,最终入选352例健康体检者的基本情况。纳入者年龄范围在30-68之间。大约有15%的参与者血压超过正常血压值。大约一半的纳入者,其血液中总胆固醇水平要高于正常值(总胆固醇正常值为<5.2mmol/L)。大于45%的为超重的人群(身高体重指数BMI>24)或者是肥胖的人群。2.不同的ELISA试剂盒影响了检测结果的多样性首先测试不同的ELISA试剂盒是否会影响结果的多样性。我们随机选取了16个人的血清样品为一个实验组,用三种不同的商业试剂盒来测量其sTRAIL的含量。其中有两个试剂盒所测得的结果具有大致上的可比性的数据,而另外一个试剂盒则测出来的数据结果差别比较大。故而在接下来的所有实验中,我们均选用R&D Systems的试剂盒来测量sTRAIL的浓度,并且这一试剂盒在现阶段的研究中,使用的频率对比其他厂家的产品而言较高。从我们的实验中可以看出,不论采用何种ELISA试剂盒,各个试剂盒之间总会存在或多或少的误差。3.在以性别,BMI,年龄为分界值分组的情况下,TC升高者中的sTRAIL水平显著升高以5.2mmol/L的TC水平为分界值,分析后发现sTRAIL的水平在血清TC水平升高组(TC-high group)中是显著升高的,且P<0.001。以TC水平在5.7 mmol/L为一个分界值,分析了sTRAIL水平的差异性。结果发现,血清TC水平升高组(TC-high group)的sTRAIL浓度为126.8±6.7pg/ml,依然要高于血清TC水平正常组(TC-Norm group)的113.6±4.1 pg/ml (P<0.005)。男性体内血清TC水平升高组(TC-high group)的sTRAIL的平均水平要显著高于血清TC水平正常组(TC-Norm group)。而女性体内sTRAIL的平均水平与男性相差无几。我们将纳入者根据其身高体重指数分为BMI<24的正常体重组(normal bodyweight)和BMI≥24的超重或者肥胖组(overweight/obese) o在这两个子组中,血清TC水平正常组(TC-Norm group)和血清TC水平升高组(TC-high group)中sTRAIL水平也具有显著地差异性。此外,在不同的年龄段中,血清TC水平升高组(TC-high group)中sTRAIL水平也显著升高。4.较高的LDL-C水平为分界值的情况下,LDL-C水平较高组血清sTRAIL水平显著高于较低组以LDL-C=3.1 mmol/L为分界值来分析,发现在血清LDL-C较低组和较高组之间并没有显著的差异,P=0.073。而在以LDL-C=3.1 mmol/L为分界值来分析时,我们发现LDL-C较高组sTRAIL水平显著高于LDL-C较低组,P<0.0005。在男性体内,LDL-C较高组sTRAIL水平的平均值显著高于LDL-C较低组。而女性体内并未出现相似的差异性。相对于身体肥胖而言,正常体重组和超重或者肥胖组中,sTRAIL水平的平均值在LDL-C较高组中显著升高。在年龄较小的纳入者一组中分析,LDL-C较高组中sTRAIL浓度为123.3±7.8 pg/ml,显著高于LDL-C较低组,二者之间存在显著地差异,P=0.0013。在年龄较大的纳入者一组中,LDL-C较高组中sTRAIL浓度高于LDL-C较低组,但二者之间并不存在差异性,P=0.1851。5.TC和LDL-C在sTRAIL水平的较高区域和较低区域之间存在差异按照血清sTRAIL水平的高低,将其分为四个区域,分别比较了sTRAIL水平较高的区域和较低的区域中,各个血生化指标之间的相关性和差异性。首先,在这两个区域中,年龄并不存在差异。其次,TC在sTRAIL较高区域中的检测值为4.89±0.08 mmol/L,要显著低于较低区域的检测值5.28±0.10 mmol/L, P=0.0056。血清LDL-C也有同样的现象。在TG, HDL-C, SBP或者DBP, BMI等中,sTRAIL水平较高的区域和较低的区域并未发现显著地相关性。结论1.在性别,BMI,年龄不同的情况下,血清总胆固醇水平与sTRAIL浓度之间具有显著的正相关关系2.在较高的LDL-C水平为分界值的情况下,LDL-C水平与sTRAIL浓度之间具有显著地正相关关系研究背景在祖国传统医学中,动脉粥样硬化在传统的中医学中并没有具体的病名。但在古籍文献中,则多以“痰浊”、“痰湿”、“血瘀”、“心痛”、“胸痹”、“真心痛”、“痰饮”、“中风”等病名概括。在其成因主要是饮食不节。饮食不节,中医上主要是过食肥甘厚味。《医学入门》中也有记载“善食厚味者生痰”。《本草经疏》中也谈到“饮啖过度,好食油面猪脂,浓厚胶固,以致脾气不利,壅滞为患,皆痰所为”。经典名著《素问·痹论》中也有对饮食不节的的记载“饮食自倍,脾胃乃伤”。另外《素问·生气通天论》中也指出要适量饮食,并提出了饱食的弊端：“因饱而食,筋脉横解,肠澼为痔。”脾胃乃后天之本,主运化饮食水谷,将水谷精微化为营血津液。过食膏脂,损伤脾胃,助湿生痰,血运不畅,不随气行,壅滞为患。在脉中,则为痰浊淤血。但是对于饱餐对脉管及血运的影响,目前尚无具体的研究。基于既往文献中对饱餐的记载,我们采用了高热量饮食,以观察饱食膏脂之品对动脉粥样硬化形成的影响。在现代医学中,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的形成是由多种致病因素导致的始发于动脉血管壁内膜层的复杂的细胞水平和分子水平改变的结果。其中高血压、高血糖、高血脂及肥胖等代谢紊乱是导致动脉粥样硬化形成的主要因素。随着生活节奏的加快,越来越多的人在选择饮食方面,多采取简便易食用的高热量饮食,并且长期高热量饮食,导致体内脂肪的集聚,血清中脂质水平的升高,进而出现动脉粥样硬化的几率要远远高于正常饮食的人群,进一步增加了罹患心脑血管疾病的危险性。心血管疾病产生的重要病理因素,是动脉粥样硬化的出现。既往研究表明,TRAIL有潜在的保护心血管疾病的作用。TRAIL基因敲除增加了高血脂小鼠的斑块面积,说明内源性的TRAIL具有保护血管抑制斑块形成的作用。我们总结了大量的体外实验发现,TRAIL的过表达,可能刺激了内皮细胞的凋亡,平滑肌细胞的增殖和迁移,泡沫细胞的形成和免疫应答。这些结果说明了,TRAIL水平的增加对血管炎症和动脉粥样硬化可能会有潜在的危害作用。因此我们认为,外源性TRAIL对血管炎症和动脉粥样硬化上的药理学作用具有一定的临床重要性。动脉粥样硬化的发生发展过程十分复杂,通常认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前,TRAIL基因缺失小鼠已经提供了可靠的证据来支持内源性的TRAIL在维持血管内稳态和抑制斑块进展方面必不可少。体内研究表明TRAIL在动脉粥样硬化的发展过程中具有一定的抑制作用。我们实验室研究发现,给予高脂饮食16周的apoE小鼠高于生理浓度的TRAIL刺激,发现其斑块面积较生理浓度组显著增大,提示我们生理浓度的TRAIL具有保护血管抑制斑块形成的作用。Death Receptor 5是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL的受体之一。20世纪末,研究者们发现了一种TNF家族细胞因子的同系物,该同系物也被认为是一种Apo-2的配体,即TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体),研究者们将其归类于TNF超家族10 (TNFSFlO)。现已发现五种TRAIL的受体。其中TRADL-R1 (DR4)和TRAIL-R2 (DR5)作为功能性的跨膜受体,可调节以TRAIL介导的细胞反应。而TRAIL-R3 (DcRl)和TRAIL-R4 (DcR2)则是不含有功能性的胞内域的膜锚定蛋白,通过竞争性结合TRAIL来拮抗DR4和DR5。另外,可溶性蛋白OPG被认为是另一个诱骗受体。但OPG与TRAIL的结合力相对较弱,并且二者之间的生理相关性仍未完全确定。在小鼠体内,仅表达DR5受体,而没有DR4。既往的研究多从TRAIL基因缺失小鼠来研究其对动脉粥样硬化斑块的作用。在小鼠体内,TRAIL的受体只存在DR5,而没有DR4,因此,我们构建了的四种双敲小鼠来研究DR5敲除后对动脉粥样硬化斑块的作用。在分别给予正常饮食和高热量饮食的条件下,观察在小鼠体内,TRAIL受体DR5敲除后,血管动脉粥样硬化斑块的面积是否有所改变。综上所述,传统医学和现代医学对饱餐和动脉粥样硬化的已经有众多论述,而DR5在饱餐诱导的动脉粥样硬化的影响目前尚未有具体的研究。因此我们根据既往文献的记载,采用了高热量饮食长期喂养双敲小鼠模拟饱餐对脉管及血运的影响,以期探讨DR5在饱食膏脂之品导致的动脉粥样硬化形成中所产生的影响。研究目的1.观察长期饱食高热量饮食条件下,双敲小鼠体重,附睾、肠系膜和肾周围脂肪垫的重量及体内血清胆固醇、血糖、高低密度胆固醇和甘油三酯等生化参数的改变。2.观察长期饱食高热量饮食条件下,DR5敲除后,双敲小鼠血管动脉粥样硬化斑块面积的改变。研究方法1.实验动物来源：8周龄雄性apoE-/-小鼠和C57BL/6为背景的野生型小鼠购自北京维通利华公司,8周龄雄性LDLR-/-小鼠购自南京大学模式动物研究所,DR5-/-小鼠购自美国Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC)。所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。2.双敲小鼠模型构建：将8周龄的apoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠分别与DR5-/-小鼠按照一雄两雌进行交配繁殖,杂一代基因型均为DR5+/- apoE+/-和LDLR+/- apoE+/-小鼠。杂一代在8周龄时继续进行模型构建,后代经鼠尾组织DNA提取后分析后分出DR5-/- apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/- LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四个基因型。3.实验分组：将上述四个基因型小鼠进行分组,每个基因型分为正常饮食组和高热量饮食组,喂养16周。4.组织样本采集：16周相应饮食后对双敲小鼠进行取材。小鼠禁食过夜,0.8%戊巴比妥钠麻醉,心尖抽取血液。分别收集心脏、血管、脂肪,肝脏、肾脏等组织于组织冻存管中,迅速放于液氮中防止其裂解,保存于-80℃冰箱备用。用于制备冰冻或石蜡切片并常规染色、组化等研究的组织则置于4%多聚甲醛,4℃固定过夜,后置于1×PBS溶液中保存。5.血脂水平检测：从小鼠心尖取血并分离血浆,并检测血浆中总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、LDL-C、HDL-C和血糖水平。6.组织学染色：进行大体组织油红O染色,分析双敲小鼠自主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉至髂总动脉斑块面积。7.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,数据分析及作图使用GraphPad Prism软件和SPSS 17.0软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验。设P<0.05为具有统计学意义。分类数据进行卡方检验。所有数据检验均为双向的。研究结果1.成功构建双敲基因型小鼠本实验以C57BL/6背景的apoE-/-和DR5-/-小鼠及LDLR-/-与DR5-/-小鼠为基础,构建双敲小鼠模型。经过一年半的时间对双敲小鼠进行基因筛选,从12547只杂合子小鼠中经过基因鉴定确定四种基因型的纯合子,分别为DR5-/- apoE-/-和DR5+/+ apoE-/-小鼠及DR5-/- LDLR-/-和DR5+/+ LDLR-/-小鼠四个基因型。2.各基因型小鼠体重结果经过16周相应饮食的喂养,其体重较最初入组时明显增加。其中各个基因型以高热量饮食喂养的小鼠体重增加相对值要远远高于正常饮食喂养的小鼠。其中DR5-/- apoE-/-高热量饮食组小鼠体重增加比例最高,DR5+/+apoE-/-高热量饮食组小鼠体重增加比例最低,但远远高于正常饮食组小鼠,并且其增加的比例与小鼠基因型无关。3.各基因型小鼠附睾、肠系膜及肾周围脂肪垫重量的结果对各基因型小鼠取材后脂肪垫的重量进行了比较。不论是以apoE-/-小鼠为基础构建的双敲小鼠,还是以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠,高热量饮食组的肠系膜脂肪垫、附睾脂肪垫及肾周脂肪垫的重量均高于正常饮食组。4.各基因型小鼠血清结果4.1不同基因型双敲小鼠体内血清胆固醇结果以apoE-/-为基础构建的两组基因型小鼠中,DR5+/+ apoE-/-与DR5-/- apoE-/-基因型小鼠HF组胆固醇高于CF组。并且在高热量饮食及正常饮食条件下,DR5敲除前后各组间均没有显著差异。而以LDLR-/-为基础构建的两组基因型小鼠体内,DR5+/+ LDLR-/-与DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠HF组胆固醇均显著高于CF组,且P<0.0001。另外,DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠HF组胆固醇显著低于DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠,且P<0.0001。4.2不同基因型双敲小鼠体内血糖结果在以apoE-/-为基础构建的敲基因小鼠体内,DR5-/- apoE-/-高热量饮食组血糖水平要低于正常饮食组,P=0.027；而以LDLR-/--为基础的敲基因小鼠体内,在DR5-/- LDLR-/-高热量饮食组血糖水平要高于正常饮食组组内且差异显著。另外,除了正常饮食组DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠体内血糖显著高于DR5-/-LDLR-/-组外,其余各组之间比较均没有统计学差异。4.3不同基因型双敲小鼠体内血清高密度脂蛋白胆固醇结果在以apoE-/-为基础构建的双敲小鼠体内,DR5-/-apoE-/-基因型小鼠HF组HDL-C水平低于CF组,而在正常饮食情况下,DR5+/+apoE-/-基因型小鼠CF组明显低于DR5-/-apoE-/-基因型小鼠。在LDLR-/-;为基础构建的双敲小鼠中,DR5+/+LDLR-/-基因型小鼠高热量饮食组血清高密度脂蛋白胆固醇水平明显高于正常饮食组。同样的DR5-/- LDLR-/-基因型双敲小鼠高热量饮食组也高于正常饮食组。但是在相同饮食条件下,仅有高热量饮食的DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠组HDL显著低于DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠组,而正常饮食组之间无差异。4.4不同基因型双敲小鼠体内血清低密度脂蛋白胆固醇结果在以apoE-/--基因型小鼠在高热量饮食16周后,DR5+/+ apoE-/-基因型小鼠HF组明显高于DR5-/- apoE-/-基因型小鼠,而正常饮食组两种基因型之间差异性没有统计学意义。以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠中,DR5+/+ LDLR-/-与DR5-/-LDLR-/-;基因型小鼠HF组LDL-C水平明显高于CF组。在同一种饮食情况下,只有16周高热量饮食后,DR5+/+ LDLR-/-基因型小鼠较DR5-/- LDLR-/-基因型小鼠血清LDL-C有显著性降低。4.5不同基因型双敲小鼠体内血清甘油三酯结果从不同基因型双敲小鼠体内血清甘油三酯比较结果来看,在以apoE-/-为基础构建的双敲小鼠体内,DR5-/- apoE-/-基因型小鼠HF组低于CF组。而以LDLR-/-为基础构建的双敲小鼠体内HF组TG均高于CF组。在正常饮食条件下,DR5敲除前后血清胆固醇水平并没有显著性差异。而高热量饮食条件下,DR5+／+LDLR-/-基因型小鼠HF组TG水平显著低于DR5-/-LDLR-/-基因型小鼠。5.不同基因型双敲小鼠主动脉弓斑块面积为了研究不同基因型双敲小鼠在高热量饮食情况下主动脉弓斑块面积的差异性,我们对构建的四种双敲小鼠进行16周的高热量饮食和正常饮食的喂养,安乐死后取材,进行油红O染色。我们首先分析apoE-/-为基础构建双敲小鼠血管主动脉弓斑块面积。高热量饮食16周后,DR5+/+ apoE-/-组主动脉弓斑块面积明显高于正常饮食组,且具有显著统计学意义。并且,在同为高热量饮食的条件下,DR5敲除后主动脉弓斑块面积明显减小,即DR5+/+ apoE-/-组主动脉弓斑块面积大于Dr5/-/ apoE-/-组,且有统计学意义。以LDLR-/-基因型为基础构建的双敲小鼠中,我们对不同饮食的各组双敲小鼠主动脉弓斑块面积进行分析,发现高热量饮食组主动脉弓斑块面积均高于正常饮食组,不论是DR5+/+ LDLR-/-基因型双敲小鼠还是DR5-/- LDLR-/-基因型双敲小鼠均有相同的结果。而相同饮食双敲小鼠中,只有高热量饮食条件下,DR5+/+ LDLR-/-组主动脉弓斑块面积大于DR5-/-LDLR-/-组,而正常饮食情况下,DR5敲除前后,以LDLR-/-基因型为基础构建的双敲小鼠血管主动脉弓斑块面积并没有差异性。结论1.双敲小鼠高热量饮食后,体重,附睾周围脂肪垫、肠系膜周围脂肪垫及肾周脂肪垫、部分血清生化参数水平等显著高于正常饮食组。2.高热量饮食条件下,双敲小鼠体内DR5敲除后主动脉弓血管斑块面积显著减小。且斑块面积的减少与体重,附睾周围脂肪垫、肠系膜周围脂肪垫及肾周脂肪垫、血清生化参数水平等的改变没有相关性。且DR5敲除后能够减小长期饱食膏脂之品诱导的动脉粥样硬化斑块面积,对动脉粥样硬化斑块的形成起到抑制作用。研究背景我们在前两章中已经论述了高热量饮食对于机体的不良影响。现代人由于生活节奏的加快,越来越多的人长期选择以高热量饮食为主,逐渐导致高脂血症、糖尿病等代谢综合征以及高血压、冠心病等心血管疾病,严重影响了人们的健康。正如《养生论》中提到的“饮食不节,以生百病”。随着生活水平的提高,现代人对饮食的要求不仅仅是为了满足机体能量代谢,更多地是注重饮食上的养生保健。《素问·上古天真论》中就提出饮食有节,起居有常,“尽终其天年,度百岁乃去”。提示了饮食与长寿密切相关。但是,维持生命活动的饮食并不意味着可以无节制的暴饮暴食。传统中医认为,饮食有节主要是适度饮食。古代养生学家葛洪也提倡饮食要有节制,并在《抱朴子·极言》中说道“食不过饱……饮不过多”。我国古代的养生学家也提出了辟谷这一概念,指的是一种修身养性的方式。主要是少吃或不吃五谷。本文的饥饿主要是指长期热量限制饮食为主。现代研究也多以热量限制饮食为主。现代研究也发现饮食有节对机体产生有益的作用。Colman等人通过对灵长类动物进行热量限制饮食研究后也发现,恒河猴老龄化死亡率显著降低,并且提示热量限制饮食能够延灵长类动物的寿命。很多流行病学发现,热量的摄入与包括心血管疾病、肿瘤、糖尿病及神经退行性疾病相关。Suzuki等人发现,人类低热量饮食可以更加健康和长寿。Fontana等人在2004年做的一项研究中发现,志愿者在热量限制饮食下显著降低了心血管疾病危险因素的发生。另外,在潘宁顿医学生物研究中心做的调查,也证实了上述观点。对于热量限制饮食与寿命之间的关系,研究者们主要集中在长寿家族基因上。因此我们选取长寿家族之一的Sirtl作为研究对象,探讨在热量限制饮食的条件下,Sirtl的改变对心肌糖脂代谢和心功能的影响及机制。研究目的1.热量限制饮食对心肌糖脂代谢的影响2.热量限制饮食对心功能的影响研究方法1.实验对象及分组C57BL/6小鼠20只,雄性,8周龄,北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将其随机分为2组：正常饮食组(CF)和热量限制饮食组(CR),每组10只,相应饮食16周。正常饮食(20.11%蛋白质,4.84%脂质,7.34%粗纤维,总能量为17.3282MJ/kg),热量限制饮食为正常饮食的30%。2.超声心动图检测在相应饮食后16周进行心脏超声心动图检测。选取频率为35MHz的超声探头进行心脏大小和功能参数的采集,采用高分辨率超声Vevo770系统进行数据分析。左室长轴和短轴切面记录超声图像。M型超声检测左室舒张末内径、左室收缩末内径、舒张末室间隔厚度、舒张末左室后壁厚度。左室短轴缩短率、射血分数和校正的左室质量由超声系统自动计算。3.实时定量-多聚酶链反应(RT-RCR):检测心肌组织的糖脂代谢相关基因PDK4、CD36、MCAD、CTPlb的mRNA表达水平。采用2-△△CT的相对定量方法分析基因的表达量。4.蛋白质免疫印迹经裂解液分别裂解组织后,提取组织总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,以电转移法将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上,经5%脱脂奶粉封闭后以特异性一抗孵育过夜,随后室温孵育二抗。用ECL化学发光液使目的蛋白条带显影,并用LAS-4000化学发光仪检测。5.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,数据分析及作图使用GraphPad Prism软件和SPSS17.0软件。两组之间比较采用曼-惠特尼检验或者是未配对的t检验。设P<0.05为具有统计学意义。研究结果1.热量限制饮食通过PI3K/AKT通路提高了心肌Sirtl的蛋白表达水平给予小鼠16周相关饮食后,安乐死取材。我们对部分心脏组织进行蛋白提取。用western blot的方法检测发现,Sirtl在热量限制饮食条件下,蛋白表达水平显著升高。检测了其上游蛋白PI3K/AKT的相关蛋白水平发现,在热量限制饮食条件下P13K蛋白水平升高,且与Sirtl升高具有相关性。P13K蛋白的下游靶点蛋白AKT的水平较正常饮食也是显著升高的。2.热量限制饮食情况下,心肌糖脂代谢相关基因表达升高利用RT-PCR的方法对心肌糖脂代谢相关基因进行检测。结果发现,糖代谢相关基因PDK4的mRNA水平热量限制饮食组较正常饮食组显著升高。CD36、MCAD、CTPlb三种脂代谢相关基因mRNA表达水平在热量限制饮食条件下显著升高。3.热量限制饮食后,小鼠心功能水平较正常饮食组无显著差异心脏超声检测发现,热量限制饮食组舒张末左室后壁厚度较正常饮食组显著变薄,P<0.05。而在两种饮食条件下,左室舒张末内径、舒张末室间隔厚度、射血分数和短轴缩短率却无显著差异,P>0.05,无统计学意义。结论热量限制饮食通过PI3K/AKT通路促进Sirtl的蛋白表达,导致心肌糖脂代谢相关基因表达水平的提高。但长期热量限制饮食对心功能的影响与正常饮食相比并无显著性差异。