西他列汀作为Januvia的主要成分,已经成为糖尿病治疗领域的有效药物。经过默克公司对西他列汀合成方法的不断改进,第三代生物酶法,即利用固定化转氨酶,以西他列汀前体酮作为底物,不对称合成西他列汀,并成功实现产业化。然而该工艺有机溶剂使用量大,存在较大的安全隐患及环境问题。本文以一种多点共价固定化方法制备固定化转氨酶,用于催化合成西他列汀,对固定化工艺流程进行优化,对固定化酶学性质进行了考察,并对填充床式固定化酶反应器催化合成西他列汀工艺参数进行了研究。本文首先研究了重组转氨酶的固定化工艺。筛选了实验室现有环氧树脂载体,选择了国产聚甲基丙烯酸树脂ES-103b树脂作为固定化载体。文章确定了最佳固定化工艺:在25?C条件下,树脂载体与酶液(6 g/L)以质量体积比1:20混合,其中转氨酶冻干粉溶解于1 M磷酸钾缓冲液(p H 7.0,2 m M PLP)中形成固定化所需的酶液。将此固定化体系置于25?C水浴震荡孵育24 h,取出固定化酶重新置于100m M,p H9.0磷酸钾缓冲液中,30?C保温30 h。取出再置于3 M,p H8.5的甘氨酸缓冲液中,25?C保温12 h。最终固定化酶比酶活达到45.6 U/g。然后我们将固定化体系同比例放大至500 m L,最终得到的固定化酶活为52.7 U/g湿载体,酶活回收率达到49.3%。其次研究了固定化酶的酶学性质。固定化酶催化反应的最适温度为50?C,在40?C,50?C,60?C温度条件下的半衰期分别为33.1 day、20.2 day、8.3 day。该酶催化反应的最适p H并没有改变,且在中性及弱碱性条件下酶活比较稳定。但超过了9.0酶活迅速降低。固定化酶对于西他列汀前体酮至西他列汀催化反应具有很好的立体选择性,产物e.e.值在99.9%以上。本文优化了固定化酶催化合成西他列汀反应条件。分别考察了氨基供体种类及浓度,底物浓度,产物浓度,助溶剂种类对催化反应影响。文章选择异丙胺作为固定化酶最适氨基供体,当异丙胺浓度为50 m M时,固定化酶活达到最高。当选择DMSO作为固定化酶催化体系助溶剂时,4 h之内催化转化率即达到40%,催化效果明显好于其它助溶剂。而对于底物,当底物浓度30 g/L,固定化酶添加量为1 g时,20 h时底物转化率即超过50%,时空产率达到0.81 g/(L.h.g湿载体)。产物对固定化酶催化转氨反应抑制作用较为强烈,当产物浓度超过15 g/L时固定化酶催化反应终止并逆向进行。最后研究了固定化酶填充床式反应器在制备西他列汀时的反应条件。确定了最优的操作条件:反应液体积200 m L,底物浓度为30g/L,填充床高径比为11:1,固定化酶填充量为30 g,底物流速为2.6 m L/min。在此条件下,底物转化率达到50%时所需的时间约为15 h。固定化酶在10批后,转化率仍保持在45%以上,酶活没有明显损失,固定化酶稳定性良好。