研究背景人工全关节置换术是治疗终末期骨关节炎的有效手段,每年大约有100万患者实施人工关节置换手术,目前无菌松动仍然是人工假体置换术后最常见的远期并发症,约20%的病人在10年内发生骨溶解和假体松动。对假体磨损研究表明:假体磨损产生数十亿磨损颗粒,假体周围组织细胞吞噬颗粒引起细胞因子释放、激发炎症反应促使破骨细胞功能活化,最终导致骨溶解和无菌松动。由于骨量是骨形成和骨丢失之间的动态平衡来维持的,来自骨髓间质干细胞的成骨细胞增加骨沉积增加骨量,来源单核巨噬细胞系的破骨细胞具有促进骨吸收的作用。炎症性细胞因子导致破骨细胞活化而促使骨溶解。两种调节破骨细胞形成的重要因子分别是细胞核因子-κB受体活化因子(RANK)和细胞核因子-κB受体活化因子培基(RANKL)。RANK是RANKL的生物信号膜受体,属于TNF受体超家族成员,在破骨细胞前体细胞、成熟破骨细胞和软骨细胞中表达,RANK同时出现在单核细胞和组织巨噬细胞,包括磨损颗粒刺激的巨噬细胞,RANKL-RANK链可以启动破骨细胞形成和成熟破骨细胞功能的活化。RANK是调节炎症性破骨细胞的重要调节因子,颗粒刺激细胞后激活RANK信号,颗粒刺激下的外周血单核细胞促进RANK转录并促进TNF-α和IL-6等细胞因子的释放。假体组件的磨损颗粒在假体松动中发挥重要作用,研究认为假体磨损颗粒激发了不同的生物学组织反应,包括骨假体界面肉芽组织的形成,巨噬细胞淋巴细胞等炎症细胞聚集、骨溶解吸收导致假体松动。在这一过程中可以观察到循环血单核细胞(PBMC)在假体部位浸润,但是其形成假体周围界膜的过程、与骨溶解的关系还不明确。为了研究磨损颗粒相关的骨溶解机理,探明破骨细胞分化以及功能活化的分子学基础。人们建立了实验模型,目前用于研究的实验模型包括体外细胞实验模型、假体植入动物模型等,但是体外实验模型得出的结论不能直接用来说明体内的过程,动物模型中常用狗,羊,马及兔等大型动物但是缺点是研究费用高,不易于饲养管理,样本含量受到限制,特别不适合新型治疗策略的研究,从而限制了这些动物模型的广泛使用。小鼠与人类具有基因同源性,利于进行生物学研究等优点,成为研究假体松动模型的新的选择。Dr.wooley实验室首创小鼠的气囊模型用来研究不同颗粒的细胞反应和骨溶解效果,为了更接近体内假体磨损颗粒环境,需要设计一理想的模型。我们设计该实验将建立模型并应用动物模型研究外周血单核细胞参与骨溶解的分子生物学机制。目的建立重度联合免疫缺陷小鼠-人假体组织(SCID-Hu)嵌合体模型,同时研究免疫抑制剂ASGM1阻断宿主免疫对人PBMC浸润的影响。利用这一改进的动物模型研究外周血单核细胞(PBMC)在假体周围组织形成中的作用,以及对促炎症细胞因子分泌的影响。同时研究聚甲基丙烯酸甲脂颗粒(PMMA)、钛铝钒合金颗粒(以下简称Ti颗粒)刺激PBMC后对细胞因子和单核细胞系标志物表达的,以及对破骨细胞分化和功能活化的影响,以探讨骨溶解的分子学机制。为临床选择假体和防治骨溶解相关的假体松动提供依据。方法本实验分为两个部分,第一部分:建立SCID-Hu人-小鼠嵌合体模型,研究PBMC的浸润规律及其对骨溶解的影响,以及ASGM1阻断宿主免疫对实验模型单核细胞分布的影响。第二部分通过SCID-Hu嵌合体模型,研究PMMA及Ti颗粒刺激对PBMC迁徙的影响和对IL-1,IL-6,TNF,RANK等细胞因子表达的影响。1.动物与分组第一部分:32只4周龄雌性重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)随机分为三组,Ⅰ组为对照组,植入人假体周围软组织和骨片,不注射PBMC细胞。Ⅱ组为注射PBMC组,植入人假体周围软组织和骨片,并注射PBMC细胞。Ⅲ组为注射PBMC合并ASGM-1处理组,植入人假体周围软组织和骨片,注射PBMC细胞和ASGM-1。第二部分:36只4周龄雌性重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)随机分为三组,每组12只,Ⅰ组为对照组,注射未经颗粒刺激的PBMC;Ⅱ组为PMMA组,注射PMMA颗粒刺激的PBMC;Ⅲ组为Ti组,注射Ti颗粒刺激的PBMC;2.PBMC标记与移植接受假体返修的病人抽取25ml外周血通过梯度离心的方法提取外周血单核细胞,细胞浓度达到5×10~6/ml。然后用PKH2绿色荧光染料标记PBMC,在荧光显微镜下观察细胞活力并采集图像,标记后的PBMC在RPMI 1640+10%胎牛血清培养基内培养,3天后两实验组每只小鼠腹腔内注射5×10~6细胞。3.SCID-Hu模型的建立假体翻修时切取病人假体周围界膜软组织和松质骨作为植入标本,假体周围软组织切成2mm~3组织块,松质骨剪成1×1×2mm~3组织块,植入左侧股四头肌、椎旁肌。SCID小鼠氯胺酮(90mg·kg^-1,ip)联合甲苯噻嗪(7.5mg·kg^-1,ip)腹腔注射麻醉,平均用量0.2ml-0.3ml。同时将其余组织块冷冻并放入-80℃低温冰箱内作为植入前的对照。4.ASGM1处理根据分组情况Ⅲ组SCID小鼠腹腔内PKH2标记的PBMC(5×10~5),以及ASGM1(200μl ip),术后7天Ⅲ组SCID小鼠腹腔内补充注射ASGM1200μl。Ⅱ组单独注射PBMC(5×10~5),不用ASGM1,Ⅰ组为PBS对照组。第二部分实验无此步骤。5组织学及免疫组织化学分析OCT包埋组织块后切取6μm厚度冰冻切片,在荧光显微镜下观察植入组织,以及宿主脾脏、肝脏、肺脏、肾脏内有无荧光细胞。经过脱钙处理的组织行HE染色观察PBMC的分布并作细胞计数。免疫组织化学染色评价外周血单核细胞标志物CD68、致炎因子(IL-1、IL-6、TNF)和破骨细胞生成调节因子RANKL的水平,抗小鼠CD68抗体检查宿主细胞情况,Image-Pro Plus系统采集免疫组织化学图片并计算积分光密度(IOD)值。6.RT-PCR检查基因表达细胞因子IL-1,IL-6,TNF,RANK,CPK和CTR通过RT-PCR方法测定其表达。7.ELISA检查ELISA方法测定IL-1、IL-6、TNF水平。8.MicroCT测定BMD术后当日及术后14天小鼠行MicroCT检测并计算骨密度的变化。结果1.异种移植物被SCID小鼠接受SCID小鼠均耐受手术操作,植入的人假体周围组织成活良好,无感染和组织排异反应,实验过程中小鼠无死亡,HE染色显示植入组织内磨损颗粒广泛分布,周围有大量细胞浸润。2.PKH2标记PBMC结果体外PKH2标记PBMC后观察,所有PBMC在荧光显微镜下均出现典型的绿色荧光表现,荧光标记可以持续6周。3.PBMC在SCID-Hu嵌合体的分布两周后取材做冰冻切片观察植入假体周围组织和宿主内脏组织荧光PBMC细胞,植入的人假体周围组织可见大量PBMC细胞浸润,小鼠脾脏内发现少量散在的荧光细胞,小鼠肾脏、肝脏、肺组织内无荧光细胞发现。注射PBMC组假体周围组织细胞数量明显多于未注射组(P＜0.05),假体周围组织中细胞浸润计数,与单纯PBMC处理组比较,ASGM1+PBMC处理组PBMC数量减少。与非颗粒刺激对照组比较PMMA颗粒组细胞计数增加(P＜0.05)。4.免疫组织化学染色结果假体周围组织中细胞浸润计数表明,ASGM1处理组比单纯PBMC处理组减少。异种移植物所有分组抗人CD68阳性细胞分布广,宿主起源的巨噬细胞(小鼠CD68阳性细胞)亦浸润假体周围组织。IOD值两个实验组CD68,RANKL,TNF与对照组比较差异显著(P＜0.05)。PMMA组和Ti组IL-1染色IOD值明显高于非颗粒刺激对照组(P＜0.05),同时Ti组TNF因子亦高于对照组(P＜0.05)。5.RT-PCR结果假体周围组织致炎性细胞因子及破骨细胞标志物的基因表达结果显示:与对照组比较,PBMC注射组明显高表达IL-1,TNF,RANK(P＜0.05)。第二部分结果显示,与无颗粒刺激对照组比较,PMMA颗粒刺激组mRNA明显高表达IL-1,TNF,RANK(P＜0.05),Ti颗粒刺激组基因表达差异不显著。6.ELISA结果ELISA测定样品中致炎细胞因子的浓度,第一部分结果:与对照组比较PBMC+PBS组IL1、IL6、TNF浓度明显提高(P＜0.05),PBMC+ASGM1组IL6浓度明显提高(P＜0.05)。第二部分结果:与对照组比较,致炎因子IL1、IL6、TNF在PMMA组和Ti组均明显升高(P＜0.05)。7.MicroCT结果假体周围组织植入SCID小鼠后,MicroCT扫描分析,第一部分结果表明,三组均有不同程度的骨密度(BMD)降低,统计学分析,PBMC组和PBMC+ASGM1组与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。第二部分结果表明与PBS对照组比较,PMMA组骨密度值明显下降,差异有显著性(P＜0.01),Ti组和PBS对照组比较,有显著性差异(P＜0.05)。结论(1)SCID小鼠对人假体组织有良好的相容性,SCID-Hu模型是研究颗粒相关的骨溶解的良好动物实验模型。(2)人外周血单核细胞在假体周围组织形成过程中发挥重要作用,PBMC可以特异性浸润到假体周围组织并对局部炎症反应发挥作用。宿主非特异性免疫细胞亦参与移植物周围细胞组成,建立SCID-Hu动物模型时,利用ASGM1阻断宿主的细胞免疫是必要的。(3)PMMA、Ti颗粒刺激可以使RANK、IL1、IL6、TNF等致炎细胞因子高表达,促进PBMC向假体组织转移,激活破骨细胞,而且不同颗粒的生物反应强度不同。(4)此实验将人假体周围组织和单核细胞同时植入重度联合免疫缺陷小鼠体内模拟人体内环境,利用此模型揭示假体周围组织形成和颗粒磨损机理,可以为临床选择假体提供依据,为预防和治疗颗粒相关骨溶解提供依据。