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第一部分 钙代谢与肺癌骨转移相关性研究背景和目的骨是实体恶性肿瘤最早转移或唯一转移的常见部位,65%～80%的乳腺癌和前列腺癌以及30%～40%的肺癌会发生骨转移,在肺癌患者中骨转移发生率可高达60%～80%。骨转移常会引起严重的骨疼痛及多种并发症,当骨质破坏以溶骨性为主时,大量骨基质被破坏释放出的钙超过肾和肠清除钙的能力,患者血钙水平明显升高。1,25-二羟维生素D[1,25-dihydroxy vitamin D,1,25 (OH)2D3]是维生素D的主要活性代谢产物,参与调节体内钙磷平衡和骨骼代谢,肿瘤患者由于食欲不振以及缺乏日照常会出现维生素D缺乏。有研究表明,在接受唑来膦酸治疗骨转移的乳腺癌患者中,血钙浓度及血清25-羟基维生素D[25-hydroxy vitamin D3,25(OH)D3]水平与乳腺癌骨转移患者的临床预后密切相关,但是在肺癌骨转移患者中尚未有相关报道。因此,本研究通过检测接受双磷酸盐治疗的肺癌骨转移患者外周血中钙离子浓度和血清25(OH)D3水平的变化,分析研究骨钙代谢与肺癌骨转移患者临床预后的相关性。材料和方法1、选取2013年1月至2014年6月收治的肺癌骨转移患者86例,肺癌无骨转移患者60例,正常人57例作为对照。2、所有肺癌骨转移患者均接受唑来膦酸治疗,4mg静脉滴注,每4周1次。测定肺癌骨转移患者在接受唑来膦酸治疗前、肺癌无骨转移患者及正常人血清钙离子和25(OH)D3浓度,动态监测肺癌骨转移患者在唑来膦酸治疗后第2、4、6、8、10、12个月的血钙和血清25(OH)D3水平变化。3、记录研究期间肺癌骨转移患者发生骨相关事件(skeletal-related events, SREs)和总生存(overall survival, OS)的情况,分析骨钙代谢与肺癌骨转移患者临床预后的相关性。结果1、肺癌骨转移组血钙基线水平明显高于肺癌无骨转移组及正常对照组(2.91±0.17 mmol/L vs2.55±0.12 mmol/L, P<0.05; 2.91±0.17 mmol/L vs2.43±0.20 mmol/L, P<0.05);血清25(OH)D3基线水平明显低于肺癌无骨转移组及正常对照组(39.65±9.57 ng/mL vs 45.88±7.24 ng/mL,P<0.05; 39.65±9.57 ng/mL vs 57.82±8.93 ng/mL,P<0.05)。2、唑来膦酸治疗后肺癌骨转移组的血钙浓度较治疗前基线水平明显下降(2.61±0.12 mmol/L vs2.91±0.17 mmol/L, P<0.05),血清25(OH)D3浓度与治疗前基线水平无明显差异(41.02±7.54 ng/mL vs39.65±9.57 ng/mL,P>0.05)。3、多因素分析结果显示,高血钙和低血清25(OH)D3是影响SREs发生的独立危险因素(OR=4.566, P=0.014; OR=3.843, P=0.040)。4、高水平血钙组发生SREs中位时间明显短于低水平血钙组(10.0个月vs12.0个月,P<0.05),但两组中位生存时间差异无统计学意义(13.5个月vs16.0个月,P>0.05)；低水平25(OH)D3组发生SREs中位时间和中位生存时间明显短于高水平25(OH)D3组(9.0个月vs13.0个月,P<0.05；12.5个月vs18.0个月,P<0.05)。结论1、血钙和血清25(OH)D3是预测接受唑来膦酸治疗骨转移的肺癌患者发生SREs的有效指标。2、25(OH)D3对评估肺癌骨转移患者的预后有一定价值。第二部分钙磷蛋白CAPS1在非小细胞肺癌骨转移中的表达及相关性研究背景和目的肺癌是目前全世界最常见的恶性肿瘤之一,是导致人类癌性死亡的首位疾病,其中非小细胞肺癌(non-small-cell-lung cancer, NSCLC)占了肺癌总体的70%。约有1／3的肺癌患者在确诊时已经发生远处转移,其中骨骼是肺癌最常见的转移部位。骨转移的病理基础主要在于肿瘤细胞与破骨细胞和成骨细胞之间发生相互作用,破坏了正常骨组织中骨吸收与骨形成的动态平衡,肿瘤细胞通过分泌细胞因子促进骨组织中钙离子的释放,在第一部分研究中我们发现血清中钙离子浓度与肺癌骨转移具有相关性,同时细胞内钙离子作为第二信使在调节肿瘤骨转移的过程中也发挥着重要作用,而参与执行这一功能的是钙结合蛋白家族成员,钙磷蛋白(calcyphosine, CAPS1)作为最新发现的钙结合蛋白家族成员,与子宫内膜癌患者的临床预后密切相关。在前期研究中,我们已通过蛋白组学方法证实CAPS1在非小细胞肺癌骨转移组织中特异性表达,在此我们将进一步研究CAPS1在非小细胞肺癌骨转移中的表达及功能。材料和方法1、取病理证实的非小细胞肺癌骨转移组织、原发性骨恶性肿瘤(骨肉瘤)及正常骨组织作为对照,利用Western blot和Real-time PCR法证实CAPS1在非小细胞肺癌骨转移组织中表达情况。2、用Western blot和Real-time PCR法分别检测CAPS1在骨转移潜能不同的非小细胞肺癌细胞中蛋白水平和RNA水平表达差异。3、构建慢病毒包装的CAPS1过表达载体,构建筛选CAPS1稳定过表达的细胞株。4、利用CCK-8实验、流式细胞技术检测等分别检测CAPS1对细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响；划痕实验和Transwell实验等方法检测CAPS1对肿瘤细胞体外侵袭等能力的影响,在体外观察CAPS1在非小细胞肺癌细胞株中的生物学作用。结果1、CAPS1在非小细胞肺癌骨转移组织中表达显著上调。2、CAPS1在低骨转移潜能非小细胞肺癌细胞A549中表达明显低于骨转移潜能较高的H1299细胞、H460细胞、SPC-A1细胞,提示CAPS1可能是一个与肺癌骨转移作用相关的蛋白。3、成功构建稳定高表达CAPS1的A549细胞株。4、体外实验证实高表达CAPS1的非小细胞肺癌细胞A549较正常表达CAPS1的A549细胞株,肿瘤细胞增殖、侵袭与转移的能力显著增强。结论CAPS1是一个新的与非小细胞肺癌骨转移密切相关的蛋白,高表达CAPS1可以显著增强非小细胞肺癌细胞A549的增殖、侵袭与迁移能力。