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研究背景及目的:肺癌是最常见的肿瘤之一,具有高发病率和高死亡率的特点,其中非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%。目前针对肺癌的外科手术及免疫治疗已经有了很大的进展,但患者的5年生存率仍不理想。据统计分析,超过90%的肺癌患者死亡是因为癌细胞的转移。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移前期的一项关键事件,多种细胞因子、信号传导通路以及转录因子与EMT的发生有关,其中转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)-β信号通路介导的EMT在肺癌的侵袭、转移过程中发挥着关键的作用。E-box锌指结合蛋白 1(Zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)是ZEB转录因子家族的一员,研究显示ZEB1在多种恶性肿瘤中高表达,参与调控癌细胞的EMT和转移过程。心肌素(MYOCD)是一种转录共激活因子,大量文献报道其与癌症密切相关,但其在NSCLC中所起作用尚未阐述,其分子机制我们尚不清楚。本研究旨在探讨NSCLC中MYOCD在TGF-β诱导的EMT过程中的作用,并深入阐明ZEB 1转录调控MYOCD的分子机制,为NSCLC的临床诊断和治疗提供新的思路和理论依据。研究方法:(1)利用慢病毒载体构建稳定过表达MYOCD的NSCLC细胞株以及构建ZEB1的瞬时过表达质粒,Real-time PCR和western blot检测MYOCD及ZEB1的过表达效率,并分析其对TGF-β诱导EMT的影响。(2)用转干扰RNA的方法敲弱NSCLC细胞中ZEB1或MYOCD的表达,Real-time PCR和western blot检测MYOCD及ZEB1的干扰效率,并分析其对TGF-β诱导EMT的影响(3)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和western blot检测TGF-β诱导下NSCLC细胞中MYOCD mRNA及蛋白表达水平。(4)构建含有MYOCD基因启动子区的双荧光报告载体,分别与ZEB1瞬时过表达质粒或ZEB1 siRNA共转染于A549细胞,双荧光素酶活性分析实验(Luciferase assay)检测过表达和敲弱ZEB1后MYOCD基因启动子区活性的变化。(5)利用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)实验验证ZEB1与MYOCD基因启动子区的结合作用。(6)利用Transwell实验分析不同处理对NSCLC细胞迁移与侵袭能力的影响。(7)Real-time PCR检测淋巴结转移及未转移的临床非小细胞肺癌样本中MYOCD和ZEB1 mRNA的表达水平,并分析两者的相关性。研究结果:(1)过表达MYOCD促进TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭,敲弱MYOCD抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭。(2)TGF-β促进NSCLC细胞中MYOCD的表达,随时间(0-24h)呈逐步上升趋势。(3)MYOCD基因启动子区存在转录因子ZEB1的结合位点,在NSCLC细胞中,ZEB1转录促进MYOCD的表达,过表达ZEB1后MYOCD mRNA和蛋白水平上调,而敲弱ZEB1后MYOCD mRNA和蛋白水平下调。(4)ZEB1可结合到MYOCD基因启动子上并正向调控MYOCD基因启动子区活性。(5)过表达ZEB1促进TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭,敲弱ZEB1抑制TGF-β诱导的NSCLC细胞EMT和迁移与侵袭。(6)在NSCLC临床组织样本中,转移组织中MYOCD和ZEB1的表达显著高于未转移组织,且两者表达呈正相关。研究结论:我们的研究揭示了转录因子ZEB1通过正向调控MYOCD促进TGF-β诱导NSCLC上皮-间质转化(EMT)的新机制,为通过调控TGF-β信号通路而干预NSCLC的侵袭转移提供了重要思路。