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车前子(PlantaginisSemen)是车前科植物车前(PlantagoasiaticL.)和平车前(PlantagodepressaWild.)的干燥成熟种子，在临床上用于治疗热淋涩痛、水肿胀满、暑湿泄泻、目赤胀痛、痰热咳喘等症。车前子中主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、黄酮类、生物碱、萜类、多糖等成分，具有利尿、降血脂、抗炎、调节免疫、抗氧化、肾保护、肝保护、促排便等药理作用。肾间质纤维化(Tubulointerstitialfibrosis,TIF)是各种慢性肾脏病发展至终末期肾病的共同病理特征，由于缺乏有效的治疗措施，TIF导致高的死亡率。因此，揭示TIF的病理机制，如何有效防治TIF是医学研究领域的难点之一。芳烃受体(Arylhydrocarbonreceptor,AhR)是配体激活的转录因子，在肾脏病中AhR激活，阐明其作用机制，对研究靶向AhR的药物具有重要意义。本论文揭示内源性芳烃类代谢产物通过激活AhR促进肾纤维化，系统研究车前子的化学成分，证明车前子中木脂素和黄酮类化合物通过抑制AhR信号通路而发挥抗肾纤维化作用。
目的：
1.揭示AhR介导肾纤维化的生物化学和分子生物学作用机制，为通过拮抗AhR而抗TIF的新药物提供作用靶点。
2．系统地研究利水渗湿中药车前子的化学成分，筛选车前子中拮抗AhR的活性成分，揭示车前子拮抗AhR的活性成分及抗TIF的作用机制。为阐明车前子发挥利水渗湿功效提供理论基础和实验依据。
方法：
1.车前子600kg，粉碎后用80%甲醇浸取，加热回流提取，提取后得到浸膏提取物，浸膏提取物再经水混悬溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液得到不同极性的萃取物。
2.将乙酸乙酯各萃取物分别采用正反相硅胶、MCI、SephadexLH-20、RP-18、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)等方法最终纯化得到单体化合物。采用1H-NMR、13C-NMR等方法确定化合物的结构。
3.选取32只体重为20-25g的雄性C57BL/6小鼠随机分为1、2和3周的UUO组与假手术对照组，利用单侧输尿管结扎(Unilateralureteralocclusion,UUO)法构建TIF小鼠模型，在第1、2和3周收集肾组织，用于病理学及代谢组学研究。进一步用单独的假手术组、UUO组和UUO+GFA组评价车前子中鉴定的化合物GFA抗TIF作用，UUO小鼠灌胃20mg/kg/d的GFA溶液(含0.5%羧甲基纤维素钠)，假手术组与模型组灌胃给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，2周结束处死小鼠收集肾组织，用于病理学分析及代谢组学研究。
4.选取体重为190-210g的80只雄性SD大鼠，随机分为5/6肾切除(NX)组与假手术组，每组80只，利用NX法构建CKD大鼠模型，在第0、1、2、3、4、5、6、9、12、20周分别随机选取8只假手术组和CKD组大鼠处死收集血清和肾组织样品，用于生化指标、病理学及代谢组学研究。我们进一步用单独的假手术组、NX组、NX+PHF组和NX+BSA组评价车前子中鉴定的化合物PHF和BSA的抗肾纤维化作用，NX大鼠分别从第9周开始灌胃10mg/kg/d的PHF和BSA溶液(含0.5%羧甲基纤维素钠)，假手术组与NX模型组灌胃给予等体0.5%羧甲基纤维素钠溶液，12周结束处死动物收集血清和肾组织样品，用于生化指标、病理学及代谢组学研究。
5.采用硫酸吲哚酚(IS)诱导的大鼠肾小管导管上皮细胞(NRK-52E)实验评价GFA抗肾纤维化活性。
6.采用超高效液相色谱-高清质谱(UPLC-HDMS)研究UUO、NX及药物干预组肾组织中代谢产物的组成及代谢差异，通过基于最小绝对收缩与选择算子模型(LASSO)选取重要的质谱变量，结合质谱碎片信息、数据库检索和对照品比较对重要的代谢产物进行结构鉴定。
7.采用SWISS-MODEL对小鼠及大鼠AhR蛋白质同源建模，采用Autodock4.0软件分析芳烃类代谢产物及车前子化学成分与AhR相互作用，通过Pymol与DiscoverStudio4.5Client软件进行相互作用力分析。
8.采用病理学方法(HE、Masson染色、免疫组织化学染色)和分子生物学方法(mRNA、westernblot、RNA过表达、RNA过干扰)分析AhR及下游靶基因(CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2)和促纤维化的蛋白(collagenⅠ、α-SMA、fibronectin、vimentin、fibroblastspecificprotein1、E-cadherin)在UUO小鼠模型和NX大鼠模型及药物干预后肾脏的表达。
结果：
1.系统的鉴定车前子的化学成分。从车前子80%甲醇提取物的乙酸乙酯部位分离鉴定了33个化合物，包括6个甾体类成分：β-谷甾醇(β-Sitosterol,CQZ-1)、7-氧代-β-谷甾醇(7-Oxo-β-Sitosterol,CQZ-2)、5α-豆甾烷-3,6-二酮(5α-Stigmast-3,6-dione,CQZ-3)、豆甾-4-烯-6β-醇-3-酮(Stigmast-4-en-6β-ol-3-one,CQZ-4)、6β-hydroxycampest-4-en-3-one(CQZ-5),6β-羟基-胆甾-4-烯-3-酮(6β-Hydroxycholest-4-en-3-one,CQZ-6)；6个酚类成分：香草酸(Vanillicacid,CQZ-7)、4-乙烯基愈创木酚(4-Vinylguaiacol,CQZ-8)、phloreticacidmethylester(CQZ-9)、methyldihydroferulate(CQZ-10)、香草醛(Vanillin,CQZ-11)、5,7-二羟基色原酮(5,7-Dihydroxychromone,CQZ-12)；2个木脂素类成分：erythro-guaiacylglycerol-β-ferulicacidether(GFA,CQZ-13)、threo-guaiacylglycerol-β-ferulicacidether(CQZ-14)；3个黄酮类成分：BarlerisidesA(BSA,CQZ-15),5,7,3,4,5-五羟基二氢黄酮(5,7,3,4,5-Pentahydroxyflavanone,PHF,CQZ-16),野漆树苷(Rhoifolin,CQZ-17)；3个苯乙醇苷类成分：异麦角甾苷(Isoacteoside,CQZ-18)、2-phenylethyl3-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranoside(CQZ-19)、木通苯乙醇苷B(CalceolariosideB,CQZ-20)；5个生物碱类成分：吲哚-3-甲醛(Indole-3-carbaldehyde,CQZ-21)、3-吲哚乙醇(3-Indoleethanol,CQZ-22)、吲哚-3-甲酸(Indol-3-carboxylicacid,CQZ-23)、3-羟基乙酰基吲哚[3-(Hydroxyacetyl)indole,CQZ-24]、acetyltryptophanmethylester(CQZ-25)；3个萜类成分：3-Oxo-α-ionol(CQZ-26)、3-oxo-7,8-dihydro-α-ionol(CQZ-27)、tricyclohumuladiol(CQZ-28)；5个脂肪酸类成分：油酸(CQZ-29)、十八烷酸(CQZ-30)、二十烷酸(CQZ-31)、正二十一烷醇(CQZ-32)和壬二酸二甲酯(CQZ-33)。其中18个化合物为首次从车前子中分离鉴定，包括：CQZ-2、3、4、5、6、8、9、11、14、15、16、19、22、24、25、26、27、28。
2.UUO导致梗阻肾组织代谢紊乱及激活AhR信号通路。代谢组学研究表明1、2和3周的UUO组与假手术组小鼠肾组织代谢物轮廓存在显著的不同。在正和负离子模式下，鉴定231个差异性代谢产物；在1、2和3周，UUO组50个代谢产物水平存在统计学显著性差异。进一步发现1-甲氧基芘、IS、6-羟基褪黑激素和5-甲氧基色胺水平在UUO组显著升高。分子对接模拟显示这4个芳烃类代谢产物能与小鼠的肾组织中AhR结合位点相互作用。
3.UUO诱导AhR激活促进EMT。首先，相对于假手术组，1、2和3周UUO小鼠肾组织细胞核中AhR显著的高表达，而细胞质中AhR显著的低表达，AhR及下游靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的mRNA显著的高表达，这些结果表明进展性的TIF伴随AhR的激活。其次，AhR过表达的UUO小鼠肾组织中1-甲氧基芘、IS、6-羟基褪黑激素和5-甲氧基色胺的水平显著升高；相反，AhR干扰的UUO小鼠肾组织这4个代谢物的水平显著的低于UUO组。AhR过表达的UUO小鼠肾组织中CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2表达显著的高于UUO组，而AhR干扰的UUO小鼠肾组织中CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2表达水平显著的低于UUO组。最后，证明促纤维化的蛋白collagenⅠ、α-SMA和fibronectin在AhR过表达的UUO肾组织显著的高于UUO组，而E-cadherin的表达显著的低于UUO组；collagenⅠ、α-SMA和fibronectin在AhR干扰的UUO肾组织表达显著的低于UUO组，而E-cadherin的表达显著的高于UUO组，这些结果证明激活的AhR促进TIF。
4.GFA通过抑制AhR信号通路而发挥抗TIF作用。首先，证明GFA能显著的改善UUO小鼠肾组织炎细胞浸润、肾小管的扩张和减少细胞外基质沉积；GFA下调UUO肾组织细胞核AhR表达水平和上调细胞质AhR的表达水平，这同时伴随下调的AhR下游靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的表达水平；进一步证明GFA显著的下调UUO肾组织中促纤维化的蛋白vimentin、FSP1、collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达、显著的上调E-cadherin表达，这些结果表明GFA抑制UUO肾组织AhR的核易位过程，从而抑制UUO诱导的TIF。其次，体外实验表明10μM的GFA能抑制IS诱导NRK-52E细胞AhR核易位、同时伴随下调CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的mRNA表达、进一步显著下调IS导致的上调的collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达并显著的上调E-cadherin表达。AhRsiRNA减弱GFA对IS诱导的EMT的抑制作用。最后，GFA下调AhR过表达的UUO小鼠肾组织中collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达并上调E-cadherin表达。
5.NX导致紊乱的内源性代谢产物和激活AhR信号通路。首先，基于肾组织代谢组学的PCA结果显示NX大鼠各个时间点(1、2、3、4、5、6、9、12、20周)均能与假手术组大鼠显著的区分开，从1周到20周，随着时间的延长，肾组织代谢产物的改变与肾损伤呈现一定的相关性。其次，采用LASSO方法选择并鉴定206个差异性代谢产物，6个芳烃类代谢产物的含量在NX大鼠的肾组织显著的升高。进一步证明1-羟基芘、1-氨基芘、1-甲氧基芘与血清肌酐水平呈正相关，与GFR呈负相关。NX大鼠肾组织的细胞核AhR的表达显著的上调，而细胞质AhR的表达显著的下调。最后，分子对接模拟证明芳烃类代谢产物能结合到AhR的活性位点。
6.黄酮类化合物PHF和BSA通过竞争性拮抗AhR而抗肾纤维化。首先，证明PHF和BSA能显著的降低NX大鼠血清肌酐、血清尿素及尿蛋白水平，改善肾功能。其次，PHF和BSA能显著的下调NX大鼠肾组织细胞核AhR表达，上调细胞质AhR表达。最后，分子对接模拟证明PHF和BSA能结合到AhR小分子结合位点，这些结果表明PHF和BSA能通过竞争性结合AhR活性位点抗肾纤维化。
结论：
本研究揭示UUO和NX诱导的进展性的肾纤维化导致内源性代谢产物的紊乱，进一步证明内源性芳烃类代谢产物通过激活AhR而促进肾纤维化的机制；从车前子中分离鉴定33个化合物，18个化合物为首次从车前子中分离鉴定；首次研究证明车前子的化学成分GFA、PHF和BSA通过拮抗AhR而抗肾纤维化，该研究阐明了车前子发挥利水渗湿功效的药效物质基础，揭示利水渗湿药车前子抗肾纤维化的生物化学和分子生物学作用机制，为开发通过拮抗AhR而抗肾纤维化提供了先导化合物，为车前子的开发和应用提供了理论基础和实验依据。
目的：
1.揭示AhR介导肾纤维化的生物化学和分子生物学作用机制，为通过拮抗AhR而抗TIF的新药物提供作用靶点。
2．系统地研究利水渗湿中药车前子的化学成分，筛选车前子中拮抗AhR的活性成分，揭示车前子拮抗AhR的活性成分及抗TIF的作用机制。为阐明车前子发挥利水渗湿功效提供理论基础和实验依据。
方法：
1.车前子600kg，粉碎后用80%甲醇浸取，加热回流提取，提取后得到浸膏提取物，浸膏提取物再经水混悬溶解，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液得到不同极性的萃取物。
2.将乙酸乙酯各萃取物分别采用正反相硅胶、MCI、SephadexLH-20、RP-18、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)等方法最终纯化得到单体化合物。采用1H-NMR、13C-NMR等方法确定化合物的结构。
3.选取32只体重为20-25g的雄性C57BL/6小鼠随机分为1、2和3周的UUO组与假手术对照组，利用单侧输尿管结扎(Unilateralureteralocclusion,UUO)法构建TIF小鼠模型，在第1、2和3周收集肾组织，用于病理学及代谢组学研究。进一步用单独的假手术组、UUO组和UUO+GFA组评价车前子中鉴定的化合物GFA抗TIF作用，UUO小鼠灌胃20mg/kg/d的GFA溶液(含0.5%羧甲基纤维素钠)，假手术组与模型组灌胃给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液，2周结束处死小鼠收集肾组织，用于病理学分析及代谢组学研究。
4.选取体重为190-210g的80只雄性SD大鼠，随机分为5/6肾切除(NX)组与假手术组，每组80只，利用NX法构建CKD大鼠模型，在第0、1、2、3、4、5、6、9、12、20周分别随机选取8只假手术组和CKD组大鼠处死收集血清和肾组织样品，用于生化指标、病理学及代谢组学研究。我们进一步用单独的假手术组、NX组、NX+PHF组和NX+BSA组评价车前子中鉴定的化合物PHF和BSA的抗肾纤维化作用，NX大鼠分别从第9周开始灌胃10mg/kg/d的PHF和BSA溶液(含0.5%羧甲基纤维素钠)，假手术组与NX模型组灌胃给予等体0.5%羧甲基纤维素钠溶液，12周结束处死动物收集血清和肾组织样品，用于生化指标、病理学及代谢组学研究。
5.采用硫酸吲哚酚(IS)诱导的大鼠肾小管导管上皮细胞(NRK-52E)实验评价GFA抗肾纤维化活性。
6.采用超高效液相色谱-高清质谱(UPLC-HDMS)研究UUO、NX及药物干预组肾组织中代谢产物的组成及代谢差异，通过基于最小绝对收缩与选择算子模型(LASSO)选取重要的质谱变量，结合质谱碎片信息、数据库检索和对照品比较对重要的代谢产物进行结构鉴定。
7.采用SWISS-MODEL对小鼠及大鼠AhR蛋白质同源建模，采用Autodock4.0软件分析芳烃类代谢产物及车前子化学成分与AhR相互作用，通过Pymol与DiscoverStudio4.5Client软件进行相互作用力分析。
8.采用病理学方法(HE、Masson染色、免疫组织化学染色)和分子生物学方法(mRNA、westernblot、RNA过表达、RNA过干扰)分析AhR及下游靶基因(CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2)和促纤维化的蛋白(collagenⅠ、α-SMA、fibronectin、vimentin、fibroblastspecificprotein1、E-cadherin)在UUO小鼠模型和NX大鼠模型及药物干预后肾脏的表达。
结果：
1.系统的鉴定车前子的化学成分。从车前子80%甲醇提取物的乙酸乙酯部位分离鉴定了33个化合物，包括6个甾体类成分：β-谷甾醇(β-Sitosterol,CQZ-1)、7-氧代-β-谷甾醇(7-Oxo-β-Sitosterol,CQZ-2)、5α-豆甾烷-3,6-二酮(5α-Stigmast-3,6-dione,CQZ-3)、豆甾-4-烯-6β-醇-3-酮(Stigmast-4-en-6β-ol-3-one,CQZ-4)、6β-hydroxycampest-4-en-3-one(CQZ-5),6β-羟基-胆甾-4-烯-3-酮(6β-Hydroxycholest-4-en-3-one,CQZ-6)；6个酚类成分：香草酸(Vanillicacid,CQZ-7)、4-乙烯基愈创木酚(4-Vinylguaiacol,CQZ-8)、phloreticacidmethylester(CQZ-9)、methyldihydroferulate(CQZ-10)、香草醛(Vanillin,CQZ-11)、5,7-二羟基色原酮(5,7-Dihydroxychromone,CQZ-12)；2个木脂素类成分：erythro-guaiacylglycerol-β-ferulicacidether(GFA,CQZ-13)、threo-guaiacylglycerol-β-ferulicacidether(CQZ-14)；3个黄酮类成分：BarlerisidesA(BSA,CQZ-15),5,7,3,4,5-五羟基二氢黄酮(5,7,3,4,5-Pentahydroxyflavanone,PHF,CQZ-16),野漆树苷(Rhoifolin,CQZ-17)；3个苯乙醇苷类成分：异麦角甾苷(Isoacteoside,CQZ-18)、2-phenylethyl3-O-(6-Deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranoside(CQZ-19)、木通苯乙醇苷B(CalceolariosideB,CQZ-20)；5个生物碱类成分：吲哚-3-甲醛(Indole-3-carbaldehyde,CQZ-21)、3-吲哚乙醇(3-Indoleethanol,CQZ-22)、吲哚-3-甲酸(Indol-3-carboxylicacid,CQZ-23)、3-羟基乙酰基吲哚[3-(Hydroxyacetyl)indole,CQZ-24]、acetyltryptophanmethylester(CQZ-25)；3个萜类成分：3-Oxo-α-ionol(CQZ-26)、3-oxo-7,8-dihydro-α-ionol(CQZ-27)、tricyclohumuladiol(CQZ-28)；5个脂肪酸类成分：油酸(CQZ-29)、十八烷酸(CQZ-30)、二十烷酸(CQZ-31)、正二十一烷醇(CQZ-32)和壬二酸二甲酯(CQZ-33)。其中18个化合物为首次从车前子中分离鉴定，包括：CQZ-2、3、4、5、6、8、9、11、14、15、16、19、22、24、25、26、27、28。
2.UUO导致梗阻肾组织代谢紊乱及激活AhR信号通路。代谢组学研究表明1、2和3周的UUO组与假手术组小鼠肾组织代谢物轮廓存在显著的不同。在正和负离子模式下，鉴定231个差异性代谢产物；在1、2和3周，UUO组50个代谢产物水平存在统计学显著性差异。进一步发现1-甲氧基芘、IS、6-羟基褪黑激素和5-甲氧基色胺水平在UUO组显著升高。分子对接模拟显示这4个芳烃类代谢产物能与小鼠的肾组织中AhR结合位点相互作用。
3.UUO诱导AhR激活促进EMT。首先，相对于假手术组，1、2和3周UUO小鼠肾组织细胞核中AhR显著的高表达，而细胞质中AhR显著的低表达，AhR及下游靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的mRNA显著的高表达，这些结果表明进展性的TIF伴随AhR的激活。其次，AhR过表达的UUO小鼠肾组织中1-甲氧基芘、IS、6-羟基褪黑激素和5-甲氧基色胺的水平显著升高；相反，AhR干扰的UUO小鼠肾组织这4个代谢物的水平显著的低于UUO组。AhR过表达的UUO小鼠肾组织中CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2表达显著的高于UUO组，而AhR干扰的UUO小鼠肾组织中CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2表达水平显著的低于UUO组。最后，证明促纤维化的蛋白collagenⅠ、α-SMA和fibronectin在AhR过表达的UUO肾组织显著的高于UUO组，而E-cadherin的表达显著的低于UUO组；collagenⅠ、α-SMA和fibronectin在AhR干扰的UUO肾组织表达显著的低于UUO组，而E-cadherin的表达显著的高于UUO组，这些结果证明激活的AhR促进TIF。
4.GFA通过抑制AhR信号通路而发挥抗TIF作用。首先，证明GFA能显著的改善UUO小鼠肾组织炎细胞浸润、肾小管的扩张和减少细胞外基质沉积；GFA下调UUO肾组织细胞核AhR表达水平和上调细胞质AhR的表达水平，这同时伴随下调的AhR下游靶基因CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的表达水平；进一步证明GFA显著的下调UUO肾组织中促纤维化的蛋白vimentin、FSP1、collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达、显著的上调E-cadherin表达，这些结果表明GFA抑制UUO肾组织AhR的核易位过程，从而抑制UUO诱导的TIF。其次，体外实验表明10μM的GFA能抑制IS诱导NRK-52E细胞AhR核易位、同时伴随下调CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和COX-2的mRNA表达、进一步显著下调IS导致的上调的collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达并显著的上调E-cadherin表达。AhRsiRNA减弱GFA对IS诱导的EMT的抑制作用。最后，GFA下调AhR过表达的UUO小鼠肾组织中collagenⅠ、α-SMA和fibronectin表达并上调E-cadherin表达。
5.NX导致紊乱的内源性代谢产物和激活AhR信号通路。首先，基于肾组织代谢组学的PCA结果显示NX大鼠各个时间点(1、2、3、4、5、6、9、12、20周)均能与假手术组大鼠显著的区分开，从1周到20周，随着时间的延长，肾组织代谢产物的改变与肾损伤呈现一定的相关性。其次，采用LASSO方法选择并鉴定206个差异性代谢产物，6个芳烃类代谢产物的含量在NX大鼠的肾组织显著的升高。进一步证明1-羟基芘、1-氨基芘、1-甲氧基芘与血清肌酐水平呈正相关，与GFR呈负相关。NX大鼠肾组织的细胞核AhR的表达显著的上调，而细胞质AhR的表达显著的下调。最后，分子对接模拟证明芳烃类代谢产物能结合到AhR的活性位点。
6.黄酮类化合物PHF和BSA通过竞争性拮抗AhR而抗肾纤维化。首先，证明PHF和BSA能显著的降低NX大鼠血清肌酐、血清尿素及尿蛋白水平，改善肾功能。其次，PHF和BSA能显著的下调NX大鼠肾组织细胞核AhR表达，上调细胞质AhR表达。最后，分子对接模拟证明PHF和BSA能结合到AhR小分子结合位点，这些结果表明PHF和BSA能通过竞争性结合AhR活性位点抗肾纤维化。
结论：
本研究揭示UUO和NX诱导的进展性的肾纤维化导致内源性代谢产物的紊乱，进一步证明内源性芳烃类代谢产物通过激活AhR而促进肾纤维化的机制；从车前子中分离鉴定33个化合物，18个化合物为首次从车前子中分离鉴定；首次研究证明车前子的化学成分GFA、PHF和BSA通过拮抗AhR而抗肾纤维化，该研究阐明了车前子发挥利水渗湿功效的药效物质基础，揭示利水渗湿药车前子抗肾纤维化的生物化学和分子生物学作用机制，为开发通过拮抗AhR而抗肾纤维化提供了先导化合物，为车前子的开发和应用提供了理论基础和实验依据。