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研究背景
氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是一类石墨烯来源的碳纳米材料，具有二维片层结构，比表面积较大。近些年，GO在电子、机械、光学以及食品衣物等制造业中的应用越来越广泛，尤其在生物医药领域。如此广泛的应用使得人体接触氧化石墨烯的机会大大增加，接触途径也多种多样，包括职业场所的经肺吸入、水体和土壤中通过生物富集作用经口进食以及生物医药领域的口服和静脉注射等。由此，GO的广泛应用给维持生态环境和生物体健康提出较大的挑战。另外，妊娠期胎儿的生长发育不仅与产后器官发育和功能形成息息相关，甚至对未来整个生命周期的健康造成影响。大量流行病学和动物实验研究证实了妊娠期对内外源性暴露比较敏感，如妊娠期暴露PM2.5、镉及烟草等均可引起流产、低出生体重、畸形率增加以及死胎等一系列不良妊娠结局。目前，已有的关于GO致胚胎毒性作用的研究局限于斑马鱼和线虫等低等动物，相关研究结果表明胚胎期暴露GO可引起胚胎死亡率上升，生长发育落后和器官出现畸形的可能性增加。而在哺乳动物模型中，关于妊娠期暴露GO致胚胎毒性作用的研究处于空白。
肠道菌群是人体最大的微生物群落，定殖在肠道内，与宿主之间互利共生，其中细菌在所有微生物种类中占比最大，可达99％。正常生理状态下，不同种属细菌的数量和比例维持在一定水平，在机体能量吸收、营养代谢以及免疫调节方面发挥重要功能。近些年，随着肠道菌群与机体生理病理机制相关研究的深入，其在维持妊娠期母亲健康和胎儿正常生长发育中的作用得到越来越多的关注。已证实孕晚期母体肠道菌群结构较其他阶段发生调整，多样性增加，以维持该时期母胎显著增加的能量和代谢需求。相反地，先兆子痫孕妇的肠道菌群结构失调，物种多样性下降，出现了宫内生长受限的不良妊娠结局。并且，有研究发现妊娠期暴露环境污染物或者纳米材料在引起胎儿发育迟缓的同时可改变对母婴健康至关重要的肠道菌群。可见，妊娠期母体的肠道菌群健康与否影响着胎儿在宫内期的生长发育。
GO具有的二维片层结构可通过机械损伤或者化学吸附至细菌细胞膜，诱导细胞损伤甚至破解死亡，从而发挥其杀菌作用。另有研究证实胃肠道暴露GO可诱导非孕小鼠和斑马鱼的菌群物种丰度下降，群落结构失调。提示妊娠期暴露GO可能破坏母体肠道菌群。暴露了GO的孕鼠体内肠道菌群发生的改变与妊娠结局有关系么？随后，我们拟在本课题中引入粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，FMT)手段，目的是探讨菌群与毒性损伤的之间的前因后果。已发现FMT被用于临床上治疗炎症性肠病、腹泻和艰难梭菌感染等多种肠道性疾病，治愈率达到90％之上。甚至，在毒理学机制研究中也发现FMT可通过重塑受损的肠道微生态以缓解肝性脑病和帕金森的症状。因此，通过探讨FMT对GO所诱导的胚胎毒性的干预效果即可明确肠道菌群在其中的作用。
研究目的
首先，我们拟建立妊娠期经口暴露GO的孕鼠模型以明确GO的胚胎毒性作用，通过分析胎盘结构和功能变化更好地理解胚胎毒性机制。其次，建立粪便菌群移植(Fecal Microbiota Transplantation，FMT)的孕鼠模型，分析FMT对GO所致胚胎发育损伤的干预情况，从而确证肠道菌群在其中的作用。最后，为分析肠道菌群的作用是否和GO的暴露方式有关系，我们进一步选择非直接接触肠道菌群的静脉方式暴露GO。研究结果可为妊娠期接触GO等其他外源性物质的安全性评估及机制研究提供参考和干预手段。
研究内容与方法
(一)妊娠期胃肠道暴露氧化石墨烯致胚胎毒性作用及胎盘损伤研究
1.表征GO的理化特性
①透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察GO的形态特征。②原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察GO在水溶液和人工模拟肠液中的表面形态和厚度。③动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测定GO在水溶液和人工模拟肠液中的粒径分布及Zeta电位。
2.建立妊娠期经口暴露GO的孕鼠模型
将孕第1天(gestational day1，GD1)的ICR孕鼠作为研究对象，随机分成对照组(0)、低(2mg/kg)、中(10mg/kg)、高剂量(40mg/kg)暴露组，每组10只孕鼠。选择器官形成期(GD7-GD16)每天按照0.2ml/10g给孕鼠进行灌胃处理。于妊娠终点(GD19)，取新鲜组织样本留待后续检测。
3.母体系统毒性评估
①于妊娠终点记录孕鼠体重、妊娠子宫重量和重要脏器重量，计算妊娠期间的净重、净增重以及重要脏器系数。②使用AU480自动血液分析仪检测各组孕鼠于GD19时血清中的血生化指标含量。
4.胚胎毒性评估
①记录各组孕鼠中发生流产、吸收胎和死胎的窝数以及每组出现异常胎仔的总数目。②计算平均每窝胎鼠的出生体重，测量活产胎仔的尾长和头臀长。③使用茜素红染色法观察胎鼠的骨骼发育情况。
5.胎盘结构及功能相关因子检测
①H&E染色观察胎盘结构。②测定还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)/氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione，GSSG)比值和总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力。③qPCR检测Claudin1、Occludin、vascularendothelialgrownfactorA(VEGFA)、interleukin-6(IL-6)在mRNA上的表达水平。④ELISA检测胎盘组织中VEGFA和IL-6蛋白的表达水平。⑤Westernblot检测Claudin1和Occludin蛋白的表达量。⑥免疫荧光实验观察Claudin1和Occludin在胎盘中的分布以及半定量。
6.统计学方法
使用Excel软件录入原始数据，SPSS20.0软件对变量在各组之间的差异进行统计学分析P＜0.05。对于符合正态分布的连续型变量，组间的差异使用方差分析，两两组间的差异使用DunnettsT分析;分类变量采用x2检验。
(二)胃肠道暴露氧化石墨烯对肠道菌群的影响及其在胚胎毒性中的作用
1.肠道损伤检查
①H&E染色观察结肠的病理组织结构。②检测异硫氰酸-葡聚糖(FITC-Dextran)在各组孕鼠血清中的荧光强度，指示各组孕鼠肠道通透性的变化。③RT-PCR检测结肠组织中Claudin1、Occludin、Muc2以及IL-6的mRNA表达水平。
2.16sRAN测序
①于妊娠终点收集孕鼠的新鲜粪便。②提取基因组DNA。③PCR扩增和纯化。④构建文库和测序。⑤对测序结果进行物种注释、多样性分析、菌群结构以及关联分析等一系列生物信息分析。
3.建立粪便菌群移植模型
①设置对照组、胃肠道方式暴露GO组和FMT组。②对GO组和FMT组的孕鼠于GD7-GD16灌胃40mg/kg的GO。③取对照孕鼠的新鲜粪便制备细菌悬浮液。④于孕晚期(GD14-GD18)，FMT组的孕鼠每天灌肠100μl的细菌悬浮液，对照组用PBS进行灌肠处理。⑤于GD19，取新鲜的组织和粪便进行后续检测。
(三)静脉暴露途径下验证肠道菌群的作用
1.建立静脉暴露GO的孕鼠模型
①设置溶剂对照组(生理盐水)、低剂量组(0.25mg/kg)、中剂量组(1.25mg/kg)、高剂量(2.5mg/kg)静脉暴露组，每组10只孕鼠。②暴露处理:于GD12和GD13每天按照5μl/g(v/m)进行尾静脉注射。③于GD19，记录相关指标并取新鲜组织留待后续检测。
2.建立粪便菌群移植模型
①设置对照组、静脉方式暴露GO组和FMT组。②于GD12和GD13连续两天对GO组和FMT组的孕鼠进行尾静脉注射2.5mg/kg的GO。③粪便菌群移植的具体方法如上所述。
研究结果
(一)妊娠期暴露氯化石墨烯致胚胎毒性作用及胎盘损伤
1.氧化石墨烯的理化特性
TEM结果显示GO纳米材料表面存在折叠和褶皱，柔韧性良好。AFM图显示GO在水和人工模拟肠液中的粒径大小分别为0.1-0.5μm和0.2-1μm，厚度均为4nm左右。DLS结果显示GO在水溶液中的平均水合粒径和Zeta电位为236±5nm和-17±3mV;而在人工模拟肠液中二者分别为766±179nm和-22±7mV。结果表明GO在模拟肠液中存在轻微聚集的现象，稳定性良好。
2.胃肠道方式暴露GO未见明显的母体系统毒性
中剂量和高剂量组的孕鼠在妊娠终点的体重相比较对照组，降低了5.67g(P＜0.01)和8.38g(P＜0.01);妊娠期总增重降低5.6g(P＜0.01)和7.58g(P＜0.01);低剂量组的相关指标变化不明显。另外，各组孕鼠在妊娠终点的净体重、妊娠期的净增重和血清中的生物化学指标都与对照组之间未见统计学的差异。
3.胃肠道方式暴露GO致胚胎毒性作用
与对照组相比，GO组的吸收胎、死胎以及出现异常胎鼠的窝数均随暴露剂量的增加而增加，同时平均每窝胎鼠数量逐渐下降。其次，中和高剂量组的每窝胎鼠平均出生体重较对照组下降，分别降低了60mg(P＜0.05)和110mg(P＜0.01)，造成妊娠期的子宫重量和单独的子宫重量明显低于对照组(P＜0.01)。另外，中、高剂量组胎鼠的头臀长比对照组的胎鼠缩短了大约2mm(P＜0.01)和3mm(P＜0.01)。同时，茜素红染色结果显示中、高剂量组的胎鼠存在肋骨、四肢骨和枕骨发育不良的现象，高剂量组胎鼠的后趾骨、腕骨的骨化点相比对照组明显减少(P＜0.05)。
4.胃肠道方式暴露GO诱导胎盘损伤
(1)胎盘结构:低剂量组孕鼠的胎盘组织结构没有出现异常。当剂量大于10mg/kg时，滋养层细胞排列紊乱，螺旋动脉变窄，甚至在高剂量组中形成失败。
(2)相关因子表达水平:整体来看，相关因子表达水平随着GO暴露剂量增加而呈现下降的趋势，低剂量组的水平变化不明显。与对照组相比，中、高剂量组胎盘VEGFA的mRNA和蛋白水平下降约1/3(P＜0.05)和2/3(P＜0.01);Claudin1和Occludin的mRNA表达水平仅占对照组的30％-50％(P＜0.05)，蛋白的表达水平占正常水平的40％-60％(P＜0.05);GSH/GSSG比值和SOD活力降低为25％和35％左右(P＜0.05);IL-6的mRNA水平增加1倍(P＜0.05)和1.7倍(P＜0.01)，蛋白水平分别增加20％(P＜0.05)和43％(P＜0.01)。
(二)胃肠道暴露氧化石墨烯对肠道菌群的影响及其在胚胎毒性中的作用
1.胃肠道暴露高剂量的GO诱导孕鼠肠道损伤
H&E染色结果显示高剂量组结肠的黏膜上皮不完整，出现空泡化。高剂量组血清中FITC-dextran的荧光强度高于正常水平一倍(P＜0.01)，同时Claudin1的mRNA水平降低87％(P＜0.05);而IL-6的mRNA水平明显增加(P＜0.05)。
2.胃肠道暴露高剂量的GO导致孕鼠的肠道菌群失调
(1)物种丰度和α多样性:高剂量组孕鼠粪便中注释到的OTUs数量和物种丰度明显低于对照组;另外，α多样性指数(Observedspecies、ACE以及Chao1)明显低于对照组(P＜0.05)。
(2)菌群结构:高剂量组孕鼠菌群中的群落构成远离对照组;β多样性数值显著下降(P＜0.05);Firmicutes/Bacteroide比值明显增加。
(3)Spearman关联分析:高剂量组降低的α多样指数、物种丰度与IL-6呈显著的负相关(P＜0.05)，与妊娠结局相关变量以及胎盘其他因子表达水平呈正相关。
3.FMT改善GO组失调的肠道菌群
(1)物种丰度和α多样性:相比于GO组，FMT组与对照组共有的OTUs数量增加，同时，稀释曲线的结果显示FMT可部分地逆转GO组降低的物种丰度。另外，FMT组的α多样性指数有所增加至接近对照组水平。
(2)菌群结构:FMT可部分地恢复GO组孕鼠中异常丰度的菌属，上升的Firmicutes/Bacteroide比值有所下调。对照组的优势菌属—乳酸球菌Lactococcus的相对丰度在GO组(0.74％)明显降低(P＜0.05)，在FMT组(4.4％)上升至接近对照组水平(5.5％)。
4.FMT在一定程度上缓解胃肠道暴露GO诱导的胚胎毒性作用
相比于GO组，FMT组的孕鼠在妊娠终点的体重增加了2.32g，但仍低于对照组(P＜0.01)。排除妊娠子宫的重量之后，孕鼠的妊娠终点净重、妊娠期净增重以及脏器系数在各组之间未见差异。另外，FMT对GO组增加的吸收胎、死胎无影响。相比于对照组，GO组每窝胎鼠的平均出生体重为1.37g，降低了100mg(P＜0.01)，而在FMT组为1.40±0.10g，比GO组明显增加，且与对照组之间无差异。由此，FMT组的妊娠子宫重量以及单独的子宫重量相比GO组明显提高，与对照水平之间的差异缩小。
(三)静脉暴露途径下验证肠道菌群在氧化石墨烯致胚胎毒性中的作用
1.静脉暴露GO诱导母体系统毒性
孕鼠的妊娠终点净体重、妊娠期净增重以及重要脏器系数在GO组与对照组之间未见明显差异，H&E染色结果显示高剂量组的孕鼠肺脏有GO纳米颗粒沉积，各组的血清生化学指标差异不明显。
2.静脉暴露GO致胚胎毒性作用
GO组的流产、吸收胎和死胎的窝数和总数都呈剂量依赖性的增加趋势。相比于对照组，中、高剂量组平均每窝的活胎数量降低了28.15％(P＜0.05)和43.64％(P＜0.01)，出生体重降低约70mg和130mg(P＜0.01);同时，妊娠终点的子宫重量和单独的子宫重量也明显减少(P＜0.01)。而低剂量组与对照组之间无差异。
3.FMT改善静脉暴露GO诱导的肠道菌群失调
(1)肠道通透性:静脉暴露GO组和GO+FMT组的孕鼠血清中FITC-dextran荧光强度明显高于对照组(P＜0.05)。
(2)菌群物种丰度和α多样性:GO组注释的特异性的OTUs数量、物种数量(P＜0.05)以及α多样性指数(ACE和Chao1)显著低于对照组(P＜0.01)，以上指标在FMT组略有增加。
(3)菌群结构:GO组的β多样性显著低于对照组(P＜0.01)和GO+FMT组(P＜0.01)。相比于对照组，GO组菌群中的Firmicutes和Staphylococcus的相对丰度升高，其在FMT组中接近对照水平;Bacteroide、Acidobacteria和Lactococcus相对丰度变化恰好相反。GO组上升的Firmicutes/Bacteroide比值在FMT组降低至正常水平。另外，菌群功能预测结果显示FMT可改善GO组降低的碳水化合物水解能力。
4.FMT可部分地缓解静脉暴露GO诱导的低出生体重
FMT组的孕鼠妊娠终点体重和妊娠期总增重虽仍低于对照组(P＜0.01)，但相比静脉暴露GO组有所增加(P＜0.05)。而各组孕鼠的妊娠终点净重、妊娠期净增重和脏器系数差异不明显。FMT对GO组明显增加的吸收胎和死胎数目，降低的平均每窝活胎数目无明显改善作用。其次，FMT组的平均每窝胎儿出生体重(1.40±0.02g)虽低于对照组(1.47±0.04g)((P＜0.01)，但相比于GO组(1.34±0.04g)明显增加(P＜0.01)。
5.FMT对静脉暴露GO诱导的胎盘损伤无影响
H&E染色结果显示GO组的胎盘结构表现异常，滋养层细胞排列紊乱，螺旋动脉的管腔随GO暴露剂量而变窄;相比于对照组，GO组的VEGFA的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，相反的IL-6mRNA和蛋白表达增加(P＜0.01)。FMT对GO组异常的胎盘结构、VEGFA和IL-6的表达水平未见干预效果。
研究结论
1.妊娠期通过胃肠道方式和静脉方式暴露GO均可诱导剂量依赖性的胚胎毒性作用。孕鼠的妊娠期体重和妊娠期的子宫重量下降;吸收胎和死胎数量增加，活产数量相应减少且出生体重降低;骨骼发育不良。在两种方式暴露GO引起胎鼠出生体重降低相近幅度的情况下，静脉方式诱导妊娠子宫重量和胎儿出生体重下降的更明显;同时出现更多数目的吸收胎和死胎。
2.胃肠道方式和静脉方式暴露GO均可引起孕鼠肠道菌群偏离对照组，物种丰度和α多样性降低;静脉方式对以上指标的影响较胃肠道方式更明显。另外，两种暴露方式下同时发现孕鼠的菌群结构失调，β多样性数值降低，Firmicutes/Bacteroide相对丰度比值增加，Lactococcus相对丰度下降。
3.FMT可逆转胃肠道GO孕鼠中降低的物种丰度和α多样性，而对静脉方式暴露GO造成的影响改善效果不明显;FMT对失调的菌群结构的干预效果明显，β多样性显著上调，失衡的Firmicutes/Bacteroide比值和Lactococcus的相对丰度也进一步恢复。
4.FMT可部分地改善GO的胚胎毒性，表现为胎鼠的低出生体重、妊娠子宫重量以及孕鼠体重上升。表明GO通过诱导孕鼠肠道菌群失调，从而加重小鼠的不良妊娠结局。
5.GO诱导孕鼠不良妊娠结局的同时，胎盘结构出现损伤，胎盘屏障相关因子表达降低;氧化应激被激活，炎性反应增加。FMT对胎盘损伤未见明显改善作用。
氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是一类石墨烯来源的碳纳米材料，具有二维片层结构，比表面积较大。近些年，GO在电子、机械、光学以及食品衣物等制造业中的应用越来越广泛，尤其在生物医药领域。如此广泛的应用使得人体接触氧化石墨烯的机会大大增加，接触途径也多种多样，包括职业场所的经肺吸入、水体和土壤中通过生物富集作用经口进食以及生物医药领域的口服和静脉注射等。由此，GO的广泛应用给维持生态环境和生物体健康提出较大的挑战。另外，妊娠期胎儿的生长发育不仅与产后器官发育和功能形成息息相关，甚至对未来整个生命周期的健康造成影响。大量流行病学和动物实验研究证实了妊娠期对内外源性暴露比较敏感，如妊娠期暴露PM2.5、镉及烟草等均可引起流产、低出生体重、畸形率增加以及死胎等一系列不良妊娠结局。目前，已有的关于GO致胚胎毒性作用的研究局限于斑马鱼和线虫等低等动物，相关研究结果表明胚胎期暴露GO可引起胚胎死亡率上升，生长发育落后和器官出现畸形的可能性增加。而在哺乳动物模型中，关于妊娠期暴露GO致胚胎毒性作用的研究处于空白。
肠道菌群是人体最大的微生物群落，定殖在肠道内，与宿主之间互利共生，其中细菌在所有微生物种类中占比最大，可达99％。正常生理状态下，不同种属细菌的数量和比例维持在一定水平，在机体能量吸收、营养代谢以及免疫调节方面发挥重要功能。近些年，随着肠道菌群与机体生理病理机制相关研究的深入，其在维持妊娠期母亲健康和胎儿正常生长发育中的作用得到越来越多的关注。已证实孕晚期母体肠道菌群结构较其他阶段发生调整，多样性增加，以维持该时期母胎显著增加的能量和代谢需求。相反地，先兆子痫孕妇的肠道菌群结构失调，物种多样性下降，出现了宫内生长受限的不良妊娠结局。并且，有研究发现妊娠期暴露环境污染物或者纳米材料在引起胎儿发育迟缓的同时可改变对母婴健康至关重要的肠道菌群。可见，妊娠期母体的肠道菌群健康与否影响着胎儿在宫内期的生长发育。
GO具有的二维片层结构可通过机械损伤或者化学吸附至细菌细胞膜，诱导细胞损伤甚至破解死亡，从而发挥其杀菌作用。另有研究证实胃肠道暴露GO可诱导非孕小鼠和斑马鱼的菌群物种丰度下降，群落结构失调。提示妊娠期暴露GO可能破坏母体肠道菌群。暴露了GO的孕鼠体内肠道菌群发生的改变与妊娠结局有关系么？随后，我们拟在本课题中引入粪便菌群移植(fecal microbiota transplantation，FMT)手段，目的是探讨菌群与毒性损伤的之间的前因后果。已发现FMT被用于临床上治疗炎症性肠病、腹泻和艰难梭菌感染等多种肠道性疾病，治愈率达到90％之上。甚至，在毒理学机制研究中也发现FMT可通过重塑受损的肠道微生态以缓解肝性脑病和帕金森的症状。因此，通过探讨FMT对GO所诱导的胚胎毒性的干预效果即可明确肠道菌群在其中的作用。
研究目的
首先，我们拟建立妊娠期经口暴露GO的孕鼠模型以明确GO的胚胎毒性作用，通过分析胎盘结构和功能变化更好地理解胚胎毒性机制。其次，建立粪便菌群移植(Fecal Microbiota Transplantation，FMT)的孕鼠模型，分析FMT对GO所致胚胎发育损伤的干预情况，从而确证肠道菌群在其中的作用。最后，为分析肠道菌群的作用是否和GO的暴露方式有关系，我们进一步选择非直接接触肠道菌群的静脉方式暴露GO。研究结果可为妊娠期接触GO等其他外源性物质的安全性评估及机制研究提供参考和干预手段。
研究内容与方法
(一)妊娠期胃肠道暴露氧化石墨烯致胚胎毒性作用及胎盘损伤研究
1.表征GO的理化特性
①透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)观察GO的形态特征。②原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察GO在水溶液和人工模拟肠液中的表面形态和厚度。③动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测定GO在水溶液和人工模拟肠液中的粒径分布及Zeta电位。
2.建立妊娠期经口暴露GO的孕鼠模型
将孕第1天(gestational day1，GD1)的ICR孕鼠作为研究对象，随机分成对照组(0)、低(2mg/kg)、中(10mg/kg)、高剂量(40mg/kg)暴露组，每组10只孕鼠。选择器官形成期(GD7-GD16)每天按照0.2ml/10g给孕鼠进行灌胃处理。于妊娠终点(GD19)，取新鲜组织样本留待后续检测。
3.母体系统毒性评估
①于妊娠终点记录孕鼠体重、妊娠子宫重量和重要脏器重量，计算妊娠期间的净重、净增重以及重要脏器系数。②使用AU480自动血液分析仪检测各组孕鼠于GD19时血清中的血生化指标含量。
4.胚胎毒性评估
①记录各组孕鼠中发生流产、吸收胎和死胎的窝数以及每组出现异常胎仔的总数目。②计算平均每窝胎鼠的出生体重，测量活产胎仔的尾长和头臀长。③使用茜素红染色法观察胎鼠的骨骼发育情况。
5.胎盘结构及功能相关因子检测
①H&E染色观察胎盘结构。②测定还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)/氧化型谷胱甘肽(Oxidized glutathione，GSSG)比值和总超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力。③qPCR检测Claudin1、Occludin、vascularendothelialgrownfactorA(VEGFA)、interleukin-6(IL-6)在mRNA上的表达水平。④ELISA检测胎盘组织中VEGFA和IL-6蛋白的表达水平。⑤Westernblot检测Claudin1和Occludin蛋白的表达量。⑥免疫荧光实验观察Claudin1和Occludin在胎盘中的分布以及半定量。
6.统计学方法
使用Excel软件录入原始数据，SPSS20.0软件对变量在各组之间的差异进行统计学分析P＜0.05。对于符合正态分布的连续型变量，组间的差异使用方差分析，两两组间的差异使用DunnettsT分析;分类变量采用x2检验。
(二)胃肠道暴露氧化石墨烯对肠道菌群的影响及其在胚胎毒性中的作用
1.肠道损伤检查
①H&E染色观察结肠的病理组织结构。②检测异硫氰酸-葡聚糖(FITC-Dextran)在各组孕鼠血清中的荧光强度，指示各组孕鼠肠道通透性的变化。③RT-PCR检测结肠组织中Claudin1、Occludin、Muc2以及IL-6的mRNA表达水平。
2.16sRAN测序
①于妊娠终点收集孕鼠的新鲜粪便。②提取基因组DNA。③PCR扩增和纯化。④构建文库和测序。⑤对测序结果进行物种注释、多样性分析、菌群结构以及关联分析等一系列生物信息分析。
3.建立粪便菌群移植模型
①设置对照组、胃肠道方式暴露GO组和FMT组。②对GO组和FMT组的孕鼠于GD7-GD16灌胃40mg/kg的GO。③取对照孕鼠的新鲜粪便制备细菌悬浮液。④于孕晚期(GD14-GD18)，FMT组的孕鼠每天灌肠100μl的细菌悬浮液，对照组用PBS进行灌肠处理。⑤于GD19，取新鲜的组织和粪便进行后续检测。
(三)静脉暴露途径下验证肠道菌群的作用
1.建立静脉暴露GO的孕鼠模型
①设置溶剂对照组(生理盐水)、低剂量组(0.25mg/kg)、中剂量组(1.25mg/kg)、高剂量(2.5mg/kg)静脉暴露组，每组10只孕鼠。②暴露处理:于GD12和GD13每天按照5μl/g(v/m)进行尾静脉注射。③于GD19，记录相关指标并取新鲜组织留待后续检测。
2.建立粪便菌群移植模型
①设置对照组、静脉方式暴露GO组和FMT组。②于GD12和GD13连续两天对GO组和FMT组的孕鼠进行尾静脉注射2.5mg/kg的GO。③粪便菌群移植的具体方法如上所述。
研究结果
(一)妊娠期暴露氯化石墨烯致胚胎毒性作用及胎盘损伤
1.氧化石墨烯的理化特性
TEM结果显示GO纳米材料表面存在折叠和褶皱，柔韧性良好。AFM图显示GO在水和人工模拟肠液中的粒径大小分别为0.1-0.5μm和0.2-1μm，厚度均为4nm左右。DLS结果显示GO在水溶液中的平均水合粒径和Zeta电位为236±5nm和-17±3mV;而在人工模拟肠液中二者分别为766±179nm和-22±7mV。结果表明GO在模拟肠液中存在轻微聚集的现象，稳定性良好。
2.胃肠道方式暴露GO未见明显的母体系统毒性
中剂量和高剂量组的孕鼠在妊娠终点的体重相比较对照组，降低了5.67g(P＜0.01)和8.38g(P＜0.01);妊娠期总增重降低5.6g(P＜0.01)和7.58g(P＜0.01);低剂量组的相关指标变化不明显。另外，各组孕鼠在妊娠终点的净体重、妊娠期的净增重和血清中的生物化学指标都与对照组之间未见统计学的差异。
3.胃肠道方式暴露GO致胚胎毒性作用
与对照组相比，GO组的吸收胎、死胎以及出现异常胎鼠的窝数均随暴露剂量的增加而增加，同时平均每窝胎鼠数量逐渐下降。其次，中和高剂量组的每窝胎鼠平均出生体重较对照组下降，分别降低了60mg(P＜0.05)和110mg(P＜0.01)，造成妊娠期的子宫重量和单独的子宫重量明显低于对照组(P＜0.01)。另外，中、高剂量组胎鼠的头臀长比对照组的胎鼠缩短了大约2mm(P＜0.01)和3mm(P＜0.01)。同时，茜素红染色结果显示中、高剂量组的胎鼠存在肋骨、四肢骨和枕骨发育不良的现象，高剂量组胎鼠的后趾骨、腕骨的骨化点相比对照组明显减少(P＜0.05)。
4.胃肠道方式暴露GO诱导胎盘损伤
(1)胎盘结构:低剂量组孕鼠的胎盘组织结构没有出现异常。当剂量大于10mg/kg时，滋养层细胞排列紊乱，螺旋动脉变窄，甚至在高剂量组中形成失败。
(2)相关因子表达水平:整体来看，相关因子表达水平随着GO暴露剂量增加而呈现下降的趋势，低剂量组的水平变化不明显。与对照组相比，中、高剂量组胎盘VEGFA的mRNA和蛋白水平下降约1/3(P＜0.05)和2/3(P＜0.01);Claudin1和Occludin的mRNA表达水平仅占对照组的30％-50％(P＜0.05)，蛋白的表达水平占正常水平的40％-60％(P＜0.05);GSH/GSSG比值和SOD活力降低为25％和35％左右(P＜0.05);IL-6的mRNA水平增加1倍(P＜0.05)和1.7倍(P＜0.01)，蛋白水平分别增加20％(P＜0.05)和43％(P＜0.01)。
(二)胃肠道暴露氧化石墨烯对肠道菌群的影响及其在胚胎毒性中的作用
1.胃肠道暴露高剂量的GO诱导孕鼠肠道损伤
H&E染色结果显示高剂量组结肠的黏膜上皮不完整，出现空泡化。高剂量组血清中FITC-dextran的荧光强度高于正常水平一倍(P＜0.01)，同时Claudin1的mRNA水平降低87％(P＜0.05);而IL-6的mRNA水平明显增加(P＜0.05)。
2.胃肠道暴露高剂量的GO导致孕鼠的肠道菌群失调
(1)物种丰度和α多样性:高剂量组孕鼠粪便中注释到的OTUs数量和物种丰度明显低于对照组;另外，α多样性指数(Observedspecies、ACE以及Chao1)明显低于对照组(P＜0.05)。
(2)菌群结构:高剂量组孕鼠菌群中的群落构成远离对照组;β多样性数值显著下降(P＜0.05);Firmicutes/Bacteroide比值明显增加。
(3)Spearman关联分析:高剂量组降低的α多样指数、物种丰度与IL-6呈显著的负相关(P＜0.05)，与妊娠结局相关变量以及胎盘其他因子表达水平呈正相关。
3.FMT改善GO组失调的肠道菌群
(1)物种丰度和α多样性:相比于GO组，FMT组与对照组共有的OTUs数量增加，同时，稀释曲线的结果显示FMT可部分地逆转GO组降低的物种丰度。另外，FMT组的α多样性指数有所增加至接近对照组水平。
(2)菌群结构:FMT可部分地恢复GO组孕鼠中异常丰度的菌属，上升的Firmicutes/Bacteroide比值有所下调。对照组的优势菌属—乳酸球菌Lactococcus的相对丰度在GO组(0.74％)明显降低(P＜0.05)，在FMT组(4.4％)上升至接近对照组水平(5.5％)。
4.FMT在一定程度上缓解胃肠道暴露GO诱导的胚胎毒性作用
相比于GO组，FMT组的孕鼠在妊娠终点的体重增加了2.32g，但仍低于对照组(P＜0.01)。排除妊娠子宫的重量之后，孕鼠的妊娠终点净重、妊娠期净增重以及脏器系数在各组之间未见差异。另外，FMT对GO组增加的吸收胎、死胎无影响。相比于对照组，GO组每窝胎鼠的平均出生体重为1.37g，降低了100mg(P＜0.01)，而在FMT组为1.40±0.10g，比GO组明显增加，且与对照组之间无差异。由此，FMT组的妊娠子宫重量以及单独的子宫重量相比GO组明显提高，与对照水平之间的差异缩小。
(三)静脉暴露途径下验证肠道菌群在氧化石墨烯致胚胎毒性中的作用
1.静脉暴露GO诱导母体系统毒性
孕鼠的妊娠终点净体重、妊娠期净增重以及重要脏器系数在GO组与对照组之间未见明显差异，H&E染色结果显示高剂量组的孕鼠肺脏有GO纳米颗粒沉积，各组的血清生化学指标差异不明显。
2.静脉暴露GO致胚胎毒性作用
GO组的流产、吸收胎和死胎的窝数和总数都呈剂量依赖性的增加趋势。相比于对照组，中、高剂量组平均每窝的活胎数量降低了28.15％(P＜0.05)和43.64％(P＜0.01)，出生体重降低约70mg和130mg(P＜0.01);同时，妊娠终点的子宫重量和单独的子宫重量也明显减少(P＜0.01)。而低剂量组与对照组之间无差异。
3.FMT改善静脉暴露GO诱导的肠道菌群失调
(1)肠道通透性:静脉暴露GO组和GO+FMT组的孕鼠血清中FITC-dextran荧光强度明显高于对照组(P＜0.05)。
(2)菌群物种丰度和α多样性:GO组注释的特异性的OTUs数量、物种数量(P＜0.05)以及α多样性指数(ACE和Chao1)显著低于对照组(P＜0.01)，以上指标在FMT组略有增加。
(3)菌群结构:GO组的β多样性显著低于对照组(P＜0.01)和GO+FMT组(P＜0.01)。相比于对照组，GO组菌群中的Firmicutes和Staphylococcus的相对丰度升高，其在FMT组中接近对照水平;Bacteroide、Acidobacteria和Lactococcus相对丰度变化恰好相反。GO组上升的Firmicutes/Bacteroide比值在FMT组降低至正常水平。另外，菌群功能预测结果显示FMT可改善GO组降低的碳水化合物水解能力。
4.FMT可部分地缓解静脉暴露GO诱导的低出生体重
FMT组的孕鼠妊娠终点体重和妊娠期总增重虽仍低于对照组(P＜0.01)，但相比静脉暴露GO组有所增加(P＜0.05)。而各组孕鼠的妊娠终点净重、妊娠期净增重和脏器系数差异不明显。FMT对GO组明显增加的吸收胎和死胎数目，降低的平均每窝活胎数目无明显改善作用。其次，FMT组的平均每窝胎儿出生体重(1.40±0.02g)虽低于对照组(1.47±0.04g)((P＜0.01)，但相比于GO组(1.34±0.04g)明显增加(P＜0.01)。
5.FMT对静脉暴露GO诱导的胎盘损伤无影响
H&E染色结果显示GO组的胎盘结构表现异常，滋养层细胞排列紊乱，螺旋动脉的管腔随GO暴露剂量而变窄;相比于对照组，GO组的VEGFA的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，相反的IL-6mRNA和蛋白表达增加(P＜0.01)。FMT对GO组异常的胎盘结构、VEGFA和IL-6的表达水平未见干预效果。
研究结论
1.妊娠期通过胃肠道方式和静脉方式暴露GO均可诱导剂量依赖性的胚胎毒性作用。孕鼠的妊娠期体重和妊娠期的子宫重量下降;吸收胎和死胎数量增加，活产数量相应减少且出生体重降低;骨骼发育不良。在两种方式暴露GO引起胎鼠出生体重降低相近幅度的情况下，静脉方式诱导妊娠子宫重量和胎儿出生体重下降的更明显;同时出现更多数目的吸收胎和死胎。
2.胃肠道方式和静脉方式暴露GO均可引起孕鼠肠道菌群偏离对照组，物种丰度和α多样性降低;静脉方式对以上指标的影响较胃肠道方式更明显。另外，两种暴露方式下同时发现孕鼠的菌群结构失调，β多样性数值降低，Firmicutes/Bacteroide相对丰度比值增加，Lactococcus相对丰度下降。
3.FMT可逆转胃肠道GO孕鼠中降低的物种丰度和α多样性，而对静脉方式暴露GO造成的影响改善效果不明显;FMT对失调的菌群结构的干预效果明显，β多样性显著上调，失衡的Firmicutes/Bacteroide比值和Lactococcus的相对丰度也进一步恢复。
4.FMT可部分地改善GO的胚胎毒性，表现为胎鼠的低出生体重、妊娠子宫重量以及孕鼠体重上升。表明GO通过诱导孕鼠肠道菌群失调，从而加重小鼠的不良妊娠结局。
5.GO诱导孕鼠不良妊娠结局的同时，胎盘结构出现损伤，胎盘屏障相关因子表达降低;氧化应激被激活，炎性反应增加。FMT对胎盘损伤未见明显改善作用。