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研究背景在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌中已有研究表明排斥导向分子B(Repulsive guidance molecules B,RGMB)表达异常与肿瘤的发生发展相关;在我们前期研究中发现肺癌组织内RGMB表达相比于正常组织低,也发现RGMB低表达与肿瘤患者差预后相关,而RGMB分子对肺癌细胞功能影响仍未知。此外RGMB作为骨形态发生蛋白质(Bone Morphogenetic Proteins,BMPs)的共表达受体,是否会参与调控BMPs信号通路仍未知。为此,我们将探索RGMB分子对肺癌细胞功能的影响,以及RGMB分子调控肺癌发生发展的具体机制。研究方法采用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测人肺癌细胞株RGMB mRNA表达水平;构建p LVX-mCMV-ZsGreen-puro-RGMB过表达载体和pLVX-ShRNA-Puro-RGMB敲低载体;用RGMB过表达和敲低载体转染293T细胞包装得到慢病毒颗粒;用病毒颗粒感染肺癌细胞从而得到RGMB稳定过表达及稳定敲低细胞株。通过细胞侵袭、黏附及转移能力来研究RGMB对细胞功能的影响。Western blot检测RGMB表达改变后BMPs信号通路中蛋白分子的表达及活化的改变。研究结果在本实验中,首先我们采用rt-PCR法在mRNA水平检测H520、Calu3、HCC827、PC-9、H1650、Am1010、SPC-A-1、A0907、H1395、H1299、A549、H460肺癌细胞中RGMB mRNA的表达情况,成功选出常用且RGMB表达相对高的人肺癌细胞株A549用于进一步实验。为了得到RGMB稳定过表达和稳定敲低的A549细胞株,首先根据RGMB基因mRNA序列全长设计引物,通过PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳得到RGMB mRNA全长DNA,根据RGMB-ShRNA序列设计正义链和反义链,退火后得到shRNA DNA序列;将PCR得到的RGMB DNA序列和退火得到的shRNA DNA序列分别与pLVX-mCMV-ZsGreen-puro和pLVX-ShRNA-Puro质粒重组,从而成功构建RGMB过表达和敲低的载体并通过PCR和基因测序验证;过表达载体和敲低载体通过转染293T细胞包装得到慢病毒颗粒;通过慢病毒颗粒感染A549细胞经筛选最终得到RGMB稳定过表达和敲低的A549细胞。为了研究RGMB基因对A549细胞功能的影响,我们选择RGMB过表达株、敲低株和对照株对比其侵袭、浸润和迁移能力,结果显示RGMB分子能抑制肺癌细胞的黏附、侵袭和转移。进一步探索RGMB是否参与BMP信号通路来影响肺癌的功能,我们选择RGMB敲低A549细胞与对照组A549细胞株,用Western blot检测BMP信号通路中蛋白分子,发现RGMB敲低组Smad-1/5/8磷酸化水平上升,差异具有统计学意义;而ERK和JNK活化水平两组相比未有明显改变。因此,我们认为RGMB可能是通过抑制Smad1/5/8通路来发挥肿瘤的抑制作用。结论RGMB抑制肺肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移;此外RGMB通过抑制Smad1/5/8信号通路从而发挥对肿瘤的抑制作用。我们的研究结果表明RGMB可能是非小细胞肺癌转移的重要抑制因子。