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喉癌是呼吸道第二大常见恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2％～3％,占耳鼻喉恶性肿瘤的11％～22％。在我国,特别是东北地区,喉癌的发病率呈逐年上升趋势。早期喉癌通常以单纯放疗或手术切除为主,对于进展期喉癌,在世界范围内,手术仍然是首选的治疗方法。但手术、放疗、化疗致残率高、并发症多、毒副作用大,因此,术后复发和转移仍是喉癌患者主要的致死原因,5年生存率很难有突破性的进展。因此,寻找有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为临床工作者关注的焦点。肿瘤生物治疗是应用现代生物技术及产品进行肿瘤防治的新疗法,它通过调动宿主的天然防御机制或者给予天然(或基因工程)产生的靶向性很强的物质达到抗肿瘤的效果。
目前,对喉癌S10OA8基因表达调控机制的研究相对有限。体外研究发现S10OA8基因表达受许多前炎症因子(TNF-a、IL-1)和其上游的转录因子(AP-1、NF-kappa B、C/EBP、Klernpt等)的调控。
尽管转录是基因表达过程中必不可少的首要阶段,但转录水平的调节对引起表型改变的功能性蛋白产物的产生并不起决定作用。未来研究的方向将集中在复杂的基因调控网络如何进化及这些进化如何引起表型改变,而实现这一目标的首要步骤即是明确调控因子及其与靶基因的相互作用机制。微小RNA(microRNA,miRNAs)是近年来发现的基因转录后调节因子,它是一长约22个核苷酸的非编码小RNA,能与靶mRNA3非翻译区(3UTR)特异性位点结合,在肿瘤发生、发展过程中发挥癌基因或抑癌基因的作用。已有文献报道miRNAs的异常表达与特定的肿瘤具有相关性。例如,慢性淋巴细胞性白血病(CLL)存在miR-15a和miR-16a表达异常;弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCI)存在miR-155表达异常;在结直肠癌中存在miR-143和miR-145表达异常;肺癌中存在let-7的表达异常。近年来,计算机技术和实验室技术的完美结合使得对miRNAs及其结合位点的研究成为可能。既往研究中,我们构建了野生型(Wt-UTR)和突变型(Mut-UTR)荧光报告素酶表达载体,通过瞬时共转染报告基因质粒和miR-24-2前体、miR-24拮抗剂到Hep2细胞中,分别检测荧光报告素酶活性及S10OA8基因在mRNA及蛋白表达水平上的改变,揭示miR-24-2前体能明显抑制野生型荧光报告素酶活性,并能降低S1OOA8基因在蛋白质表达水平的改变,而miR-24拮抗剂能逆转这一效应,该结果表明在体外环境下喉癌Hep2细胞中miR-24-2能靶向负性调节S10OA8基因的表达。在体内情况下,miR-24-2是否也具有相同或相似的作用,是本研究拟解决的关键问题。本研究在利用瞬时转染技术将S100A8报告质粒和miR-24-2前体转染到Hep2细胞中,并建立裸鼠喉鳞癌移植肿瘤动物模型,利用动物模型观察裸鼠移植瘤的生长情况,阐述miR-24-2在喉癌治疗中的作用;检测移植瘤组织内S10OA8的表达,验证miR-24-2在体内环境中对S10OA8基因的靶向负性调控作用。相信对S10OA8基因及其调控因子miR-24-2深入了解,不仅有助于认识生命过程,而且有助于以miRNAs为靶点的新药开发,从而为肿瘤和其它疾病的治疗提供新的线索。
材料与方法：
本研究在利用瞬时转染技术将S100A8报告质粒和miR-24-2前体转染到Hep2细胞中,并建立裸鼠喉鳞癌移植肿瘤动物模型,观察荷瘤裸鼠动物模型的体重变化及肿瘤大小绘制生长曲线以裸鼠移植瘤组织标本为实验材料,应用免疫组化、RT-PCR和Western Blot检测喉磷癌组织中S100A8的表达水平。
实验结果1、Hep2细胞体外荧光素酶报告基因活性检测结果显示:共转染Lut-S100A8-Wt+Pre-miR-24组报告基因活性相对于其它各组明显降低,具有统计学意义(P<0.05);2、荷瘤裸鼠肿瘤体重和体积检测结果显示:共转染Lut-S100A8-Wt+Pre-miR.24组的裸鼠体重显著增加、肿瘤体积显著降低(P<0.05);3、RT-PCR结果显示:裸鼠移植瘤组织中Pre-miR.24+Lut-S100A8-Wt组、Pre-miR-24组和Control miR组的SIOOA8 mRNA与β-actin的平均灰度比值分别为0.6234±O.136,0.674±0.098,0.608±0.203。Pre-miR-24+lut-S100A8-Wt组S1OOA8基因mRNA水平与对照组相比无显著变化(P>0.05);4、免疫组化结果显示:转染Pre-miR-24组和共转染Lut-S100A8-Wt+Pre-miR-24组的S100A8蛋白表达水平与空白对照组相比明显降低;5、Western Bolt结果显示:裸鼠移植瘤组织中Pre-miR-24+Lut-S100A8-Wt组Lut-S100A8-Wt组、Pre-miR-24组和Control miR组的S100A8蛋白与β-actin的平均灰度比值分别为0.623±0.167,1.437±0.375,1.014±0.706和1.697±0.158。Pre-miR-24+Lut-S100A8-Wt组S100A8蛋白表达水平显著低于其他组(P<0.05)。
结论：在体内miR-24-2通过抑制SIOOA8表达抑制喉癌细胞的生长。