烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是一类配体门控通道。该类型的受体通道是由不同的亚基组成的同源五聚体(α9α10 nAChR)或者异源五聚体(α4β2nAChR),在生物体内广泛分布,并且在人类与大鼠的生理过程与病理模型中发挥重要的功能。目前研究表明,乙酰胆碱受体有着重要的研究价值,比如:α9α10 nAChR与慢性神经痛以及尼古丁成瘾等疾病有关:α4β2 nAChR与大鼠神经炎症模型和抑郁模型以及尼古丁成瘾模型密切相关。α-芋螺毒素GID是海洋生物芋螺分泌的(包含19个氨基酸)活性多肽,具有CC-C-C模式的半胱氨酸骨架,可以结合α4β2nAChR,α3β2nAChR等乙酰胆碱受体。因此ct-芋螺毒素GID被认为是可能特异性作用于α4β2 nAChR的候选多肽,其突变体将有可能作为α4β2 nAChR专一性抑制剂为相关疾病的研究提供新的思路。根据GID的丙氨酸扫描研究以及最近的计算机算法研究结果,GID突变体是特异性结合α4β2 nAChR的潜在结构,但目前存在的问题是GID与α4β2 nAChR的结合机制并未得到清楚地解释,尚未找到具有很好的活性或者选择性的GID突变体。而α9α10 nAChR是目前研究比较全面的乙酰胆碱受体,目前研究发现α-芋螺毒素RgIA与Vc1.1都可以特异性作用于α9α10 nAChR,部分在α9α10 nAChR上参与结合的关键氨基酸都已经被鉴定出来,但是这两种作用于相同受体的α-芋螺毒素的结合机制是否相同还需要进一步研究。因此,本文的研究目的:第一部分:以计算机模拟技术为设计手段,以loop定位结合口袋,建立计算水平的结合模型,判断GID与α4[32nAChR的可能结合机制并对突变体进行结构改造设计,合成以及活性检测,以期望解释GID与α4β2nAChR的构效关系,为突变体的设计提供理论基础。第二部分:以计算机模拟技术为设计手段,在充分参考有关文献的基础上,选出受体结合面α9(+)ct10(-)和α10(+)α9(-),以loop定位结合口袋,使用分子对接,分子动力学模拟等手段,进行关键氨基酸的鉴定,寻找普遍存在的结合机制,为突变体的设计提供理论支持。本文使用的研究方法:第一部分:通过阳性对照与阴性对照实验进行突变体结构与抑制活性之间的关系分析,本文分别在配体的第一位,第四位,第九位,第十六位与第十八位设计了多种突变体,涵盖了静电相互作用,疏水相互作用,空间位阻等突变方向,设计14个突变体,分别以α3β2和α4β2nAChR的非洲爪蟾卵母细胞生物模型,重复使用电生理膜片钳技术检测GID系列突变体的抑制活性,n=3-7,期望能够全面的研究芋螺毒素GID与α4β2 nAChR的相互作用。根据非洲爪蟾卵细胞电生理模型检测结果,本文发现GID-N端位置的正电氨基酸突变体与负电氨基酸突变体对α4β2 nAChR的活性有显著性差异,同时对α3β2 nAChR的活性无显著影响,其他位置的突变体对α4β2 nAChR失活而对α3β2 nAChR无明显影响。第二部分:本文通过计算机辅助药物设计手段,设计4种结合模型,发现α-芋螺毒素RgIA与Vcl.1与α9α10乙酰胆碱受体具有相似的受体关键氨基酸作用区域。同时发现α-芋螺毒素RgIA与α9α10乙酰胆碱受体的负电氨基酸(α10(-)亚基的Glu197,α9(-)亚基的Asp168和α10(+)的Asp205)产生显著地相互作用,而α-芋螺毒素Vcl.1与α9α10乙酰胆碱受体位于(α9(-)亚基的正电氨基酸Arg59,Arg81)产生显著地相互作用。由此总结,本文的研究结果:1.GID-N端在结合α4β2nAChR时,静电相互作用可能是主要的贡献;2.在结合面α14(/)β2(-)上,位于2(-)亚基上的氨基酸Asp 170可能在结合中起到关键作用:3.在计算水平上发现了静电相互作用可能在α-芋螺毒素与α9α10乙酰胆碱受体的结合模型中存在贡献。结论:本文分别建立了 4个α9α 10乙酰胆碱受体的结合模型(50ns)和7个α4β2乙酰胆碱受体的结合模型(50ns),分别利用计算模拟手段从约400个受体氨基酸中分析得到约20个参与结合的受体关键氨基酸,分析其中氨基酸结合自由能贡献,根据贡献最大的受体氨基酸分析寻找结合机制。另外本文在第一部分中根据结合机制设计GID突变体,进行电生理活性检测,发现GID-N端以静电相互作用在α4β2nAChR参与受体配体结合,而不参与在α3β2nAChR中的受体配体结合,这解释了配体GID对不同受体具有选择的原因;在第二部分中发现静电相互作用在计算水平上也出现在与α9α10乙酰胆碱受体的结合中。因此静电相互作用可能是一个未来重要的突变方向。本研究为下一步乙酰胆碱受体的专一性突变体的设计与研究提供了理论基础。