【摘 要】
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抗菌肽和凝集素属于鱼类非特异性免疫因子,它们不仅是抵抗病原体感染的第一道防线,还可以激活特异性免疫应答。本研究从黄姑鱼（Nibea albiflora）的转录组数据库中筛选出了3个凝集素基因和2个抗菌肽基因,分别命名为YdGal-3、YdGal-9、YdGal-1、YdNkl-1和YdNkl-2,并对它们的分子特征和免疫功能进行了研究,主要结果如下:YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1属
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抗菌肽和凝集素属于鱼类非特异性免疫因子,它们不仅是抵抗病原体感染的第一道防线,还可以激活特异性免疫应答。本研究从黄姑鱼（Nibea albiflora）的转录组数据库中筛选出了3个凝集素基因和2个抗菌肽基因,分别命名为YdGal-3、YdGal-9、YdGal-1、YdNkl-1和YdNkl-2,并对它们的分子特征和免疫功能进行了研究,主要结果如下:YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1属于半乳糖凝集素（galectin）家族,没有信号肽和跨膜区,具有保守的糖结合基序和糖识别结构域（carbohydrate recognition domain,CRD）。YdGal-3编码383个氨基酸,YdGal-9编码349个氨基酸,YdGal-1编码135个氨基酸。实时荧光定量PCR（q RT-PCR）结果表明,YdGal-3、YdGal-9、YdGal-1广泛表达于所检测的黄姑鱼12种组织或器官中,其中YdGal-3在脑中的表达量最高,YdGal-9在肾脏和肝脏中的表达量较高,YdGal-1在鳔和鳃中的表达量较高。经哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染后,黄姑鱼头肾、肝脏和脾脏中的YdGal-3表达量均明显升高;脑中YdGal-9和YdGal-1的表达量均明显升高。亚细胞定位结果表明,黄姑鱼YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1在HEK 293T细胞的细胞质和细胞核中均有分布。经原核表达纯化出的YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1蛋白在不依赖Ca2+的作用下都能凝集家兔、大黄鱼（Larimichthys crocea）和黄姑鱼的红细胞。此外,YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1蛋白还具有细菌凝集活性并表现出抗菌活性。YdGal-3能够凝集4种革兰氏阴性菌,包括变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维氏弧菌和嗜水气单胞菌（Aeromonas helphia）;YdGal-9能够凝集6种革兰氏阴性菌,包括变形假单胞菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌（Escherichia coli）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）;YdGal-1能够凝集6种革兰氏阴性菌,包括迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、大肠杆菌和明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。通过扫描电子显微镜也发现,YdGal-3可以使变形假单胞菌和副溶血弧菌的细胞膜产生破损。糖抑制实验表明,YdGal-3、YdGal-9和YdGal-1的凝集活性受到乳糖、D-半乳糖和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）等糖类的抑制,通过缺失糖结合基序进一步研究了YdGal-3和YdGal-9的凝集机制,结果表明不同的糖结合基序可以结合不同的糖类。这些结果表明YdGal-3、YdGal-9、YdGal-1在黄姑鱼的先天免疫中起重要作用。抗菌肽基因YdNkl-1编码158个氨基酸,YdNkl-2编码151个氨基酸。YdNkl-1和YdNkl-2均具有一个信号肽和一个鞘脂激活蛋白B（saposin B）结构域。q RT-PCR结果表明,YdNkl-1和YdNkl-2广泛表达于所检测的黄姑鱼12种组织或器官中,其中YdNkl-1在皮肤的表达量最高;YdNkl-2在鳃和脾脏中的表达量较高。经哈维氏弧菌感染后,YdNkl-1在肝脏和脾脏中的表达量明显升高;YdNkl-2在头肾、肝脏和脾脏中的表达量均明显升高。亚细胞定位结果表明,YdNkl-1和YdNkl-2在HEK 293T细胞的细胞质和细胞核中均有分布。另外,通过原核表达纯化出了His-YdNkl-1蛋白,为进一步研究抗菌肽的功能及开发免疫增强剂等奠定了基础。
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