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褪黑素由松果体合成并释放到体内循环系统中。在人类和动物机体中,它不仅参与调节外周器官的昼夜节律,同时参与调控衰老和组织器官发育等多种生理过程。除松果体能够合成褪黑素外,在肝脏、肾脏、皮肤、肠道、血小板和淋巴细胞等多种组织和细胞中均发现了褪黑素相关酶及其受体。褪黑素的功能已经得到了广泛研究,并以其抗炎、抗氧化、抗癌等特性,被作为多种疾病的潜在治疗药物。但是,内源性褪黑素不足的系统效应以及与疾病之间的关系尚未报道。因此,本研究通过CRISPR-Cas9技术全身敲除褪黑素合成限速酶芳基烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）编码基因,建立内源性褪黑素不足的（Endogenous Melatonin deficiency,EMD）小鼠模型。首先,对EMD小鼠重要生理特征进行观察,然后,揭示了小鼠重要组织和器官转录组及血清代谢组特征,并研究了EMD与阿尔兹海默症（AD）和肥胖间的关系及机制。最后,通过粪菌移植（FMT）进一步验证肠道菌群在AD和肥胖中的介导作用。主要研究内容及结果如下:1.EMD小鼠模型的构建及重要生理特征观察本研究首先对EMD小鼠血清褪黑素水平、体重、繁殖性能、葡萄糖耐量、胰岛素耐量及主要组织器官的组织学特征进行检测。结果显示,Aanat-/-小鼠血清褪黑素水平极显著降低（P＜0.001）,表明EMD动物模型建立成功。与WT组相比,EMD组小鼠从出生到9周龄体重无显著差异。睾丸重量检测及切片结果显示,两组小鼠睾丸重量无差异,EMD小鼠睾丸未出现病理特征。合笼试验结果显示EMD小鼠具有生育能力。葡萄糖耐量（GTT）和胰岛素耐量（ITT）试验结果显示,EMD小鼠表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。组织学特征观察显示,EMD未导致10周龄成年小鼠大脑、心脏、肝脏、肾脏、肺、皮肤、胃、脾脏、骨骼肌和e WAT明显病理特征。上述结果表明,EMD不影响小鼠体重和繁殖性能。EMD未导致10周龄小鼠重要组织器官明显病理特征。但是,EMD导致小鼠代谢紊乱,表现为葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。2.EMD小鼠重要组织器官转录组和血清代谢组特征本研究探究了EMD对小鼠11个组织器官转录组和血清代谢组的影响。选择大脑、心脏、肝脏、肾脏、肺、皮肤、胃、脾脏、睾丸、骨骼肌和e WAT作为研究目标。结果显示,EMD组与WT组小鼠相比,11个组织器官转录组存在明显差异,共发现8321个差异表达基因（DEGs）（Log2Fold Change＞2或＜0.5且P＜0.05）。其中,3209个基因相对表达水平显著上调,5112个基因相对表达水平显著下调。GO和KEGG富集分析结果显示,EMD小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺和睾丸中部分显著富集的通路功能与组织特异性疾病相关。进一步分析发现,部分组织中DEGs相对表达量的变化与其在组织特异性疾病发病机制和预后不良中的变化一致。血清代谢组结果显示,EMD导致小鼠血清30种代谢产物水平发生改变,30种差异代谢产物显著富集于16条代谢途径。这些代谢途径主要与氨基酸代谢和脂质代谢相关。上述研究结果表明,与WT组相比,EMD小鼠转录组和血清代谢组发生显著变化,EMD可能与组织特异性疾病的发病机制和预后不良有关。3.EMD小鼠肠道菌群特征EMD不影响小鼠肠道菌群的Alpha多样性。然而,肠道菌群Beta多样性发生显著变化,EMD小鼠肠道菌群组成在门、纲、目、科、属水平均发生变化。LEf Se（LDA Effect Size）分析显示了两组小鼠中相对丰度存在显著差异的所有物种。与WT组小鼠相比,EMD组小鼠肠道拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著降低（P＜0.05）,乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度显著增加（P＜0.05）,厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门相对丰度比值存在显著差异（P＜0.05）。与WT组相比,EMD组小鼠肠道炎症标志物LCN2水平极显著上调（P＜0.01）,肠道通透性极显著增加（P＜0.001）。同时,EMD导致血清促炎细胞因子TNF-α和MCP-1显著上调（P＜0.05）。皮尔逊关联分析结果显示,促炎细胞因子TNF-α和MCP-1水平与Ruminiclostridium5相对丰度分别呈极显著正相关（P＜0.01）和显著正相关（P＜0.05）。上述结果表明,EMD导致小鼠肠道菌群失调（Gut microbiota dysbiosis）,伴随肠道炎症和肠道通透性增加。同时,EMD导致全身炎症,这可能与Ruminiclostridium5相对丰度增加有关。4.EMD与AD和肥胖的关系AD血清标志物检测结果显示,与8月龄WT组小鼠相比,8月龄EMD组小鼠血清尿酸水平显著降低（P＜0.05）,血清轻度AD前驱标志物T-tau蛋白水平显著增加（P＜0.05）。与WT组小鼠相比,EMD组小鼠大脑促炎细胞因子TNF-α和IL-6水平显著增加（P＜0.05）。海马体组织免疫荧光分析结果显示,EMD组小鼠小胶质细胞激活,Aβ蛋白沉积。T迷宫试验结果显示,EMD小鼠空间记忆能力显著下降（P＜0.05）。10周龄成年WT和EMD小鼠连续10周同时饲喂高脂（HF）日粮,通过体重、GTT、ITT和肝脏油红o染色等检测,探究EMD与肥胖间的关系。结果显示,基础日粮饲喂的两组小鼠体重变化无显著差异。从第四周开始,EMD+HF组小鼠的体重显著高于WT+HF组小鼠（P＜0.05）,直至第十周结束。EMD+HF组小鼠e WAT重量显著高于WT+HF组小鼠（P＜0.05）,肾周脂肪组织和肝脏重量极显著高于WT+HF组小鼠（P＜0.01）,EMD+HF组小鼠肝脏脂肪变性明显增加。GTT和ITT试验结果显示,EMD+HF组与WT+HF组小鼠相比表现出更加明显的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。上述结果表明,EMD导致8月龄小鼠AD样表型,加剧了高脂诱导小鼠的肥胖,降低了小鼠对应激的抵抗能力。5.粪菌移植缓解EMD小鼠AD和肥胖症状FMT显著改善了8月龄EMD小鼠的肠道通透性（P＜0.05）,显著降低了肠道炎症标志物LCN2、血清促炎因子TNF-α和MCP-1水平（P＜0.05）。同时,FMT缓解了8月龄EMD小鼠大脑小胶质细胞激活和Aβ蛋白沉积。高脂饮食饲喂小鼠FMT试验结果显示,FMT显著降低了EMD小鼠体重（P＜0.05）,缓解了肝脏脂肪变性、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗的严重程度。结果表明,FMT能够缓解EMD导致的小鼠肠道通透性增加、肠道炎症和全身炎症。同时,FMT能够缓解EMD导致的AD样表型和肥胖加剧。综上所述,本研究确定了EMD后的系统性变化,阐明了EMD与疾病之间存在的可能关联。此外,发现EMD导致的肠道菌群失调能够介导AD样表型,降低了机体抵抗应激的能力。证明EMD可能是一种新的AD发病机制,也可能与肥胖症发病机制有重要关联。本研究为褪黑素在人类疾病中的作用提供了新的见解。