【摘 要】
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抗生素的过度、不当使用和在环境中的累积形成了巨大的选择压力,极大地加快了环境中耐药细菌(ARB)的产生和富集,诱导了环境中耐药基因(ARGs)的扩散与传播。生活污水是抗生素和ARGs的重要环境库,城市污水处理厂作为生活污水的集中处理场所,其核心目的是保障出水安全,而消毒处理是保障出水生物安全性的关键措施。氯化消毒和紫外消毒因其各自的优势,已成为目前最常用的两种消毒方式。但是传统的细菌培养和分子生物
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抗生素的过度、不当使用和在环境中的累积形成了巨大的选择压力,极大地加快了环境中耐药细菌(ARB)的产生和富集,诱导了环境中耐药基因(ARGs)的扩散与传播。生活污水是抗生素和ARGs的重要环境库,城市污水处理厂作为生活污水的集中处理场所,其核心目的是保障出水安全,而消毒处理是保障出水生物安全性的关键措施。氯化消毒和紫外消毒因其各自的优势,已成为目前最常用的两种消毒方式。但是传统的细菌培养和分子生物学方法无法全面解析活、死菌的群落结构和耐药基因组,也无法系统、深入地分析消毒压力下群落结构和ARGs多样性与丰度的变化特征。本文选取南京市某污水处理厂出水为研究对象,在实验室条件下设置了氯化、紫外及其联合消毒的梯度剂量实验,系统比较不同消毒方式对生活污水中群落结构、ARGs和可移动遗传元件(MGEs)的影响规律;此外,为甄别对消毒剂不敏感且存活的微生物并揭示其耐药性特征,本文通过叠氮溴化丙锭(PMA)技术+多重置换扩增(MDA)技术以及宏转录组技术,从活菌微生物组角度研究了氯化消毒和紫外消毒对群落结构和ARGs的影响,并通过宏基因组和宏转录组的方法确定ARGs的潜在宿主。研究的内容和结论如下。(1)氯化、紫外消毒前后群落结构的变化特征通过设置氯化、紫外及其联合消毒的梯度剂量实验,利用Illumina Miseq高通量测序和宏基因组分析,并结合聚类分析,探究了生活污水中群落结构的变化特征。结果表明氯化消毒和紫外消毒存在消毒剂量的临界点,其中氯化消毒是40 mg/L,紫外消毒是40 mJ/cm2,当消毒的剂量超过该临界点时,群落结构不再随消毒剂量的升高而变化,此时氯化消毒对群落结构的改变幅度大于紫外消毒。氯化消毒和紫外消毒对不同类细菌的去除能力有所差异:氯化消毒能够大幅降低变形菌门和放线菌门的相对丰度,但可富集绿菌门和绿弯菌门;紫外消毒能够大幅降低变形菌门的相对丰度,但可富集厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻门和绿弯菌门。此外,联合消毒可以有效去除对单一消毒剂不敏感的细菌。(2)氯化、紫外消毒前后耐药基因组的变化特征利用Illumina Hiseq高通量测序和宏基因组分析,设置氯化、紫外及其联合消毒的梯度剂量实验,研究生活污水中耐药基因组(ARGs和MGEs)的变化特征,并通过Network分析探究群落结构、MGEs与ARGs之间的相关性。结果表明氯化消毒和紫外消毒均能够降低生活污水中ARGs的相对丰度,但去除能力有一定限度和偏好性:在ARGs类型方面,氯化消毒能够去除各类型的ARGs,但会富集大环内酯-林可酰胺-B链阳霉素类(Macrolide-lincosamide-streptogramin B,MLSB)ARGs,而紫外消毒基本不能去除四环素类、多重耐药类和磺胺类ARGs;在耐药机制方面,氯化消毒能够去除各类耐药机制的ARGs,而紫外消毒只能够去除抗生素酶破坏类和外排泵类ARGs。另外,联合消毒对ARGs和MGEs的去除效果与氯化消毒相似,但强于紫外消毒。(3)氯化、紫外消毒前后活菌的群落结构和ARGs的变化特征通过PMA+MDA技术、Illumina Hiseq高通量测序、宏基因组和宏转录组分析,探究氯化消毒前后活菌的群落结构和ARGs分布特征;通过Illumina Hiseq高通量测序,并将宏基因组和宏转录组测序序列进行组装,探究紫外消毒前后菌群结构和ARGs多样性的变化。结果表明氯化消毒(0.5 mg/L)后活菌的群落结构和ARGs分布与活、死菌混合的样本差异较大,说明添加PMA有助于揭示真实的菌群结构和ARGs分布;且菌群结构、ARGs和MGEs丰度的mRNA分析结果与DNA分析结果有明显差异。紫外消毒(20 mJ/cm2)导致耐药基因转录本的相对丰度轻微下降,但MLSB类转录本的相对丰度显著上升。从活菌测序的角度,氯化消毒相对于紫外消毒对生活污水中菌群结构和ARGs的影响更显著。
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