小麦成熟胚再生体系的建立及其遗传转化的初步研究

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随着分子生物学的发展,利用基因工程技术进行小麦的遗传改良,已成为育种研究的一个方向。再生体系和转化体系的建立对基因工程育种具有重要意义。但小麦(Triticum aestivumL.)属于异源六倍体植物,基因组庞大,重复序列多,再生能力差,遗传转化比较困难。本研究以小麦成熟胚为外植体,对影响再生的关键因素包括外植体类型及处理方式、植物激素种类和光照条件等进行了实验,建立了稳定的再生体系;并探索了农杆菌介导小麦胚源愈伤组织的转化条件,初步建立了胚源愈伤组织的遗传转化过程;另外,本研究首次尝试了以幼胚的生长点为受体,进行农杆菌介导的直接转化,初步确定了幼胚生长点直接转化的可行性,以期为小麦转基因育种提供理论依据及技术支持。  主要研究结果如下:  (1)以小麦成熟籽粒为起始材料,研究了外植体类型及处理方式、植物激素种类和光照条件等因素对小麦再生的影响。结果表明:①成熟胚的再生效率,优于幼苗叶基切段,成熟胚的愈伤组织诱导率及再生率均高于幼苗叶基切段,且再生率差异显著;②完整胚在整个再生阶段均表现较差,发芽率显著高于切割胚,而愈伤诱导率和分化率又显著低于切割胚;③附加2,4-D和Picloram均可以高频率地诱导成熟胚愈伤组织的形成,但Picloram诱导形成的愈伤组织质量较好,多为致密的淡黄色胚性愈伤组织,分化率高于2,4-D达2倍之多;④愈伤诱导阶段光照培养,可以影响愈伤组织的质量,提高分化率。成熟胚先黑暗培养14 d,再转入光照条件下继续诱愈培养,分化率显著提高,可达22.84%。  (2)以Bobwhite成熟胚愈伤组织为受体,农杆菌LBA4404(含  pCAMBIA3304-Tri101质粒)为供体材料,研究了愈伤组织预培养时间、农杆菌侵染时间和共培养方式对转化效率的影响。结果表明:①随着预培养时间的增加,GUS瞬时表达率增加,但愈伤组织的再生能力下降,当预培养时间为14 d时,愈伤组织的GUS瞬时表达率及再生能力均较好;②以OD600=1.0的农杆菌重悬液,侵染处理3 h时,愈伤组织的GUS瞬时表达率最高,在保证转化率的前提下,再生能力较好;③在共培养阶段进行干燥处理,可明显提高愈伤组织的GUS瞬时表达率及再生能力。在三个处理中,均辅以组织再生相关基因的相对表达量分析,发现再生相关基因相对表达量的变化与愈伤组织的再生能力变化呈正相关。最终确定,小麦成熟胚预培养14 d后,农杆菌侵染3 h,共培养阶段经干燥处理,是根癌农杆菌介导成熟胚愈伤组织转化的合适条件。  (3)以日龄1~3 d及7 d的小麦幼胚为受体,利用携带Gus基因的农杆菌LBA4404侵染,恢复培养至3~5叶期时,取第三叶进行GUS组织化学染色分析;并做两个优化对比处理:①抽真空处理:在侵染过程中,0.1 MPa抽真空2 min;②干燥处理:在共培养阶段,将幼胚转入铺有干燥无菌滤纸的平皿中。结果表明:GUS瞬时表达率随日龄增加而降低,以2~3 d龄的幼胚为最高;抽真空和干燥处理均能显著提高GUS瞬时表达率。最终,在优化处理条件下,获得77株转化苗中,40株第三叶GUS染色显示阳性,高达51.95%。进一步提取GUS阳性小麦叶片基因组DNA,进行PCR扩增,有6株转化苗扩增出目的条带,转化率为7.79%。初步说明以小麦幼胚的生长点作为转化受体是可行的。
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