伪狂犬病毒(pseudorabies vims，PRV)是引起多种家畜和野生动物伪狂犬病的病原体。PRV属疱疹病毒科，a疱疹病毒亚科，基因组为约150 kb的线性双链DNA。PRV具有宿主范围广、不感染人、可供外源基因插入或替代的非必需基因位点多以及插入外源基因容量大等特点，在构建动物病毒载体方面具有明显优势。缺失PRV毒力基因，将外源保护性抗原基因插入PRV基因组表达，构建基因工程缺失疫苗和多价疫苗是目前伪狂犬病防治研究的热点。目前PRV疫苗存在的一个问题就是，尽管可以抑制疾病的爆发，但是不能抵抗病毒的感染，所以免疫之后的家畜仍然可以携带并传播病毒。这主要是由于PRV在长期的进化过程中形成了多种逃避宿主免疫系统的机制。研究发现，作为疫苗开发中主要抗原的gB和gD蛋白在病毒免疫逃逸过程中具有重要的促进作用，这包括两个方面：(1)gB和gD都可以促进抗体诱导的细胞表面的病毒糖蛋白的内吞作用；(2)gB还促进了病毒在细胞间的直接传播。上述功能的发挥与其胞内区含酪氨酸的基序YXXФ密切相关，该结构的突变可使其丧失以上功能。另外，PRV也是疱疹病毒的—个重要模式病毒。PRV功能基因组学的研究对理解疱疹病毒复制和致病的机理具有重要意义。然而，由于疱疹病毒结构非常复杂，对其进行系统的遗传学研究相当困难。细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC)技术为疱疹病毒等的遗传学研究开辟了新的道路，使得对病毒基因组进行系统的遗传学分析成为可能。尽管如此，含有疱疹病毒的基因组的BAC往往很大，不能采用酶切、连接等常规的技术操作，所以基因工程改造仍然相当困难。 本研究分为以下三个方面： 首先，为了构建PRVTK-/GFP突变体，首先提取伪狂犬病毒(PRV)湖北株基因组DNA为PCR扩增模板，并根据GenBank已发表的基因序列，选择保守序列设计了两对引物，分别扩增出位于UL23分别扩增出位于UL23即胸苷激酶(Thymidine Kinase TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂长度为1781bp包括部分UL25、全部UL24、部分TK，下游同源臂长度为包括部分TK及部分UL22，上游同源臂和下游同源臂的拼接片段中TK基因内部缺失842个核苷酸。将两个同源臂克隆于pBluescriptSK+载体上，获得pSK-1781-1968；再将绿色荧光蛋白载体pEGFP-N1上含GFP完整的基因表达盒插入pSK-1781-1968的上游同源臂和下游同源臂之间构成转移载体pSKAaXG。提取pSKAaXG质粒，经单酶切线性化后用脂质体转染BHK21细胞，转染24h后，再以10MOI的野生型PRV进行感染。过夜培养之后在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)筛选的重组病毒。最后通过蚀斑纯化获得PRVTK-/GFP突变株。依据缺失区域两侧序列设计引物，PCR结果证实了TK的缺失与GFP表达盒的插入。这为进一步开发病毒疫苗载体提供了基础。 其次，为了研究gB和gD胞内区YXXФ基序的功能以及对这两种抗原免疫效果的影响，首先设计两对引物分别扩增出PRV湖北株的gB和gD基因，并克隆到真核表达载体pcDNA3.1+上。测序结果显示gB基因全长为2751 bp编码916个氨基酸，gD基因全长为1209 bp编码402个氨基酸。然后依据测序结果，再设计针对胞内区YXXФ中基序的突变引物，通过PCR或重叠PCR获得gB和gD基因的YXXФ基序突变体，并将各突变体克隆到pcDNA3.1+上。通过酶切和测序证实获得了与预期相同的突变体。这为进一步研究gB，gD YXXФ基序在免疫逃逸中的作用，以及开发更加有效的疫苗奠定了基础。 最后，为了利用Tn7介导的转座快速构建重组PRV，首先设计两对引物，分别扩增出上游同源臂和下游同源臂，克隆至pBluescript SK+载体匕，然后将lacZ α-mini-attTn7插入两同源臂之间，获得转移载体。在大肠杆菌内，通过同源重组将lacZ α-mini-attTn7插入伪狂犬病毒(PRV)细菌人工染色体(BAC)gG与gD基因间的非转录区，获得重组BAC pBeckerZF1。测序结果显示lacZ α-mini-attTn7插入位点位于gG基因的polyA转录终止信号下游44 bp，以及gD基因的TATA转录起始信号上游23 bp处，不造成任何病毒基因和功能元件的破坏。然后利用Tn7介导的转座将绿色荧光蛋白基因导入pBeckerZF1的mini-attTn7位点获得了pBeckerZF2。通过转染将pBeckerZF1和pBeckerZF2分别导入PK15细胞获得重组病毒vBeckerZF1和vBeckerZF2。结果表明vBeckerZF1与野生型病毒vBecker3一步生长曲线没有明显区别。vBeckerZF2在细胞中连续传代五次。