研究背景:　　 蛋白尿不仅是各种肾小球疾病最常见的临床表现，同时也是肾小球滤过膜生理屏障受损的主要标志。长期以来，人们对蛋白尿的发生机制缺乏深入的了解。　　 近年来的研究显示，肾小球性蛋白尿发生的根本原因在于肾小球滤过膜生理屏障受损，而肾小球上皮细胞（即足细胞）则是保持肾小球滤过膜功能完整性的关键因素。很多先天性肾病综合征患者的发病是由于Nephrin、Podocin、α-Acitin-4、Synaptopodin等基因的突变引起的，上述基因Knock-out的模型动物也出现了蛋白尿及肾小球上皮细胞足突融合等病变，表明这些表达在肾小球上皮细胞的足突分子（如Nephrin、Podocin、CD2AP、TRPC6）及细胞骨架相关蛋白（如Synaptopodin、α-Acitin-4、Podocalyxin等）对维持肾小球滤过膜完整性、阻止血浆蛋白漏出起着重要作用。足细胞可以通过细胞F-actin的收缩与扩张调整自身形态，改变细胞之间的滤过间隙和超滤系数从而适应肾小球滤过容积的改变，这一功能的完成主要依赖于其强大的细胞骨架系统，而Ⅰ型肌球蛋白的功能与细胞骨架密切相关。前期的研究发现，Ⅰ型肌球蛋白分子中Myole是斑马鱼、小鼠乃至人类肾小球上皮细胞的重要组成成分，与足细胞的生理功能密切相关;Myole基因敲除的斑马鱼及小鼠出现蛋白尿以及慢性肾损害症状，肾小球滤过膜的结构及其功能的完整性发生显著破坏;我们的前期通过体外Knock-down小鼠足细胞Myole后发现，足细胞的增值、黏附、抗损伤能力及内吞作用受损;提示肾小球上皮细胞中Myole分子的存在对肾小球滤过膜的结构及功能的完整性是不可或缺的。　　 目的:　　 为研究Myole表达变化对足细胞功能及其相关机制的影响，本研究通过体外过表达Myole，观察其对足细胞功能的影响。　　 方法:　　 1)小鼠肾小球足细胞培养。　　 2)细胞免疫荧光法鉴定足细胞及细胞骨架蛋白。　　 3)根据上海吉玛公司设计的过表达质粒对足细胞进行瞬时转染，并设立空白组及空载组。　　 4) RT-PCR方法从mRNA水平，检测基因过表达效果，以β-actin作为内参基因，相对定量方法分析基因表达差异。　　 5)应用Western-blot方法从蛋白水平，检测基因过表达效果，以β-actin作为内参基因，经过Image J软件分析，半定量分析蛋白表达的差异。　　 6)细胞免疫荧光法检测各处理组足细胞形态学变化。　　 7)细胞免疫荧光法检测Myole过表达后足细胞骨架蛋白的变化。　　 8) ELISA法检测各个实验组Myole蛋白表达情况，分别设定4个实验点，即24小时、48小时、72小时、96小时，检测细胞的OD值。　　 9) Transwell小室评估各个处理组细胞迁移能力。　　 10)用50ug/ml的PAN（嘌呤霉素）处理各组细胞后，培养48小时后，计数贴壁细胞数，统计学分析。　　 11)消化后各处理组细胞后以相同密度接种于六孔板中，37℃孵育1小时后，倒掉培养基，细胞计数，观察黏附能力。　　 12)各处理组细胞用FITC-Transferrin培养液孵育后，观察细胞内吞作用。　　 结果:　　 1.Myole主要分布于足细胞胞浆，且向周边聚集。CD2AP和Synaptopodin作为鉴定足细胞的蛋白分子，可见足细胞内有明显特异的表达。　　 2.RT-PCR检测mRNA的相对表达变化:Myole过表达组与空白组有差异P=0.033;空载组与空白组无明显差异，P=0.731。　　 3.Western-blot检测蛋白的相对表达变化:Myole过表达组与空白组有差异P=0.04;空载组与空白组无明显差异，P=0.1994。　　 4.Myole过表达后，免疫荧光法检测细胞中荧光变化情况，过表达组细胞荧光强度稍强于其他组，且Myole蛋白胞浆分布增多。　　 5.ELISA法检测各组Myole蛋白表达情况:随着时间的延长，过表达组Myole蛋白含量下降缓慢，而空白组和空载组Myole蛋白含量下降明显。　　 6.不同处理组骨架蛋白F-actin的变化:Myole过表达组足细胞F-actin细胞定位并未发生改变，同时过表达组足细胞F-actin增加并不十分明显。　　 7.足细胞体外Transwell迁移实验:在400倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞数;空白组细胞迁移数为141±7.582个，Myole过表达组足细胞迁移数179±4.301个，空载组细胞迁移数138±5.916个，经过单因素方差分析发现过表达组与空白组之间P＜0.01，具有明显统计学差异;而空白组与空载组之间P＞0.05，无明显统计学差异。　　 8.足细胞黏附实验:37℃孵育1小时，计数贴壁细胞数。结果显示过表达组细胞黏附能力增加，400倍显微镜下计数结果显示，空白组细胞数均值为27.6667±4.3805个，空载组细胞数均值为26.0833±4.2525个，Myole过表达组为52.1667±5.7340个，统计学结果分析表明，过表达组与空白组之间P＜0.01，具有明显统计学差异;而空白组与空载组之间P＞0.05，无明显统计学差异。　　 9.足细胞分离实验:不同处理组足细胞经过PAN作用48小时后，计数贴壁细胞数。空白组贴壁细胞数为59.4±4.6152个，空载组贴壁细胞数为56.8±3.5637个，过表达组为80.6±4.5607个;统计学结果分析表明，过表达组与空白组之间P＜0.01，具有明显统计学差异;而空白组与空载组之间P＞0.05，无明显统计学差异。　　 10.足细胞内吞作用检测，免疫荧光结果显示过表达组细胞较空白组细胞内吞作用增强，而空白组与空载组细胞荧光强度相差不大。　　 结论:　　 1.Myole在足细胞的生长过程中，参与了足突的形成。　　 2.Myole在维持足细胞的正常形态发挥重要作用。　　 3.Myole过表达后足细胞的增值能力，黏附能力，抗损伤能力及内吞作用增强，Myole是足细胞发挥正常的细胞功能不可缺少的组成成分。