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川芎嗪又名四甲基吡嗪,是吡嗪类生物碱,具有多种药理作用,但其制备方法——化学合成和直接提取都存在一定的不足,而微生物发酵法由于其产品绿色天然、成本低、环境污染小的优点备受关注。纳豆菌(Bacillusnatto)是从纳豆中分离出来的益生菌,能产生多种生理活性代谢物,也可发酵制备川芎嗪。因此利用纳豆菌发酵制备川芎嗪具有一定的现实意义。
本课题主要研究内容:纳豆菌的分离纯化、鉴定筛选;利用GC-MS技术分析超高压处理对纳豆香气成分的影响;通过HPLC检测确认发酵液中川芎嗪的存在并建立其检测方法;最后以川芎嗪的含量为主要指标对纳豆菌液态发酵培养基成分和培养条件进行优化。提供一种川芎嗪的生物制备方法,也为纳豆菌的进一步研究提供理论基础。研究结论如下:
(1)从纳豆中分离纯化得到三株菌株,经鉴定均为纳豆菌,以感官品质为主要指标筛选出适合发酵纳豆的菌种NT-1,通过测定其生长曲线,确定纳豆菌最佳接种龄为6～10h。将纳豆菌扩大培养并制备冻干粉,其最适添加量为0.1%。
(2)通过GC-MS检测分析并结合Guadagni香气值理论,确定纳豆的主要香气成分为己醇、1-辛烯-3-醇、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-庚酮、2,5-二甲基吡嗪等;经超高压400MPa处理10min能较好地保留并改善纳豆的香气;同时检测出纳豆香气中有川芎嗪(四甲基吡嗪)的存在。
(3)建立了高效液相色谱检测发酵液中川芎嗪的方法,色谱柱为Agilent20RBAX.SBC18柱(4.6mm×250mm,5μm),检测条件:检测波长为290nm;流动相为水相(1%乙酸和0.05%三氟乙酸):甲醇=45:55(v/v);流速为0.8mL/min;进样量为2μL。该检测方法精密度高(RSD<5%),稳定性和重现性好(RSD<5%),回收率在93%～98%之间,因此该方法适合发酵液中川芎嗪的检测。
(4)液体发酵液中川芎嗪的提取方法为:量取发酵液5mL,加20mL三氯甲烷超声波萃取1h,真空抽滤后滤液加25mL0.2mol/L的盐酸萃取。
(5)通过单次因子法,确定葡萄糖为最佳碳源,最适浓度为1.5%;蛋白胨为最佳氮源,最适浓度为1%。将单次因子法和响应面法(RSM)结合建立了纳豆菌发酵液中川芎嗪含量和发酵条件(发酵温度x1、接种量x2、发酵时间x3)之间的数学模型:Y=-235.42875+14.66062x1+8.2225x2+10.74625x3+0.011250x1x2-0.0325x1x3-0.3775x2x3-0.2575x12-0.7675x22-1.265X32。优化得到最佳发酵条件:发酵温度为28.37℃、接种量4.79%、发酵时间3.17d,在此条件下发酵液中川芎嗪的含量最高为9.25μg/mL。