海发菜提取物的分离纯化以及功能活性研究

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【目的】  1.优化海发菜总多酚的提取工艺,提高提取效率。  2.采用不同有机溶剂分段萃取,进一步鉴定新化合物的结构。  3.测定海发菜不同溶剂提取组分的体外抗氧化活性效果。  4.考察海发菜酸性多糖对体外酪氨酸酶活性的抑制作用。  5.初探海发菜酸性多糖对UVB诱导小鼠皮肤光损伤的保护作用。  【方法】  1.利用乙醇冷凝回流提取海发菜总多酚。通过考察提取时间、液料比、提取温度和乙醇浓度等4个因素对提取总多酚的影响,并采用福林酚法测定总多酚的含量。比较正交试验和响应面试验的最佳提取工艺,确定最佳提取条件。  2.采用乙醇提取,石油醚和乙酸乙酯分段萃取,得到不同的有效组分,进一步经柱层析和高效液相色谱分离纯化,获得新的化合物单体。采用核磁共振(NMR)等波谱检测手段确定新化合物单体的结构。  3.通过体外抗氧化活性实验,测定不同溶剂提取组分对自由基的清除能力,包括DPPH自由基、羟基自由基和超氧化物阴离子。  4.采用碱提取和乙醇提取,得到两种不同的海发菜酸性多糖。通过多巴氧化法,测定不同浓度的海发菜酸性多糖对酪氨酸酶活性的抑制作用。  5.在UVB诱导小鼠皮肤光损伤的部位涂抹海发菜酸性多糖。观察小鼠皮肤组织切片的病理学变化,检测皮肤匀浆和血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平。  【结果】  1.比较正交试验法和响应面试验法的优化结果,结合实际情况,确定海发菜总多酚的优化提取条件为:提取时间100min、提取温度60℃、乙醇浓度70%、液料比30ml/g。在此条件下,海发菜总多酚的含量为(8.15±0.42)mg/g。  2.利用有机溶剂分段萃取得到各混合组分,包括石油醚组分、乙酸乙酯组分和水相组分。采用高效液相色谱法进一步的分离纯化,并通过多种波谱检测手段鉴定出不同组分的主要化学成分。在石油醚组分的主要成分为多不饱和脂肪酸类化合物。在乙酸乙酯组分成功鉴定出一个新的单体化合物:叶绿素衍生物羟基脱镁叶绿素a。在水相组分存在糖的特征峰,且含有β型糖苷键的特征吸收峰(892cm-1)。  3.通过体外抗氧化活性实验,测得各组分对自由基的清除能力有差异。清除DPPH自由基,各组分都呈现出一定的清除能力,且在一定浓度范围内有着良好的量-效应关系,当浓度达到100mg/L时,乙酸乙酯组分呈现出很强的清除能力为94%。清除·OH自由基,各组分都呈现出较好的清除能力,当浓度达到100mg/L时,各组分清除能力约为70%。清除O2-·自由基,各组分的清除能力都不强。另外,通过对比不同提取组分的总多酚含量与抗氧化活性的相关性,表明它们之间存在一定的相关性。  4.通过体外抗酪氨酸酶活性实验,发现2种海发菜酸性多糖均对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用,呈现浓度依赖性,且均表现为可逆性抑制。进一步的酶动力学测定,它们的抑制类型均为竞争型抑制。  5.通过UVB诱导小鼠皮肤光损伤的实验,发现海发菜酸性多糖涂抹给药组的小鼠皮肤红斑比模型组的少,结痂脱落时间快,且表皮层厚度较薄;另外小鼠血清和皮肤匀浆中的T-SOD和GSH-Px酶含量比模型组的高,且MDA含量低。  【结论】  1.通过优化提取条件,可以提高提取海发菜总多酚的含量。  2.利用有机溶剂分段萃取,可以分离出不同的活性组分;结合色谱进一步的分离纯化,能够得到单一的化合物单体。  3.海发菜的不同提取组分对DPPH自由基、·OH自由基和O2-·自由基都具有一定的清除能力,且各组分的总多酚含量与抗氧化能力之间存在一定相关性。  4.海发菜酸性多糖对体外酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用。  5.海发菜酸性多糖能够清除由UVB照射引起的活性氧自由基,具有一定的护肤作用。
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