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植物抗病性是一个极其复杂的过程。植物抗性调控基因的克隆和功能分析有利于深入了解植物抗病性的分子机理。天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase, AS) (EC 6.3.5.4)通常由一个小的基因家族所编码。该酶为广泛存在于原核和真核生物体内的一类氨基转移酶,以氨或谷氨酰胺以及天冬氨酸为底物催化天冬酰胺的生物合成。它能增强氮从源组织到库组织的重新定位,通过调节氮代谢参与多种生物学功能的调控。然而AS对植物抗病性的调控功能尚不明确。本研究拟分别克隆番茄和水稻AS基因,并采用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术和转基因超量表达和RNAi技术,研究AS基因对植物抗病性的调控功能。获得如下结果：1番茄和水稻天冬酰胺合成酶基因的克隆：根据已知的核苷酸序列,设计番茄和水稻共四对引物,分别以番茄和水稻的cDNA为模板,采用RT-PCR法克隆获得获得长度为1680bp的SlAS1、长度分别为1776bp、1815bp、1512bp的OsAS1、OsAS3和OsAS4全长cDNA序列。2天冬酰胺合成酶基因的抗病功能分析：采用VIGS技术和瞬时超表达分析了AS基因对番茄和本氏烟抗病的调控功能。发现SlAS1基因在番茄沉默植株产生的Cf4/Avr(?)介导产生的过敏性反应(hypersensitive response, HR)症状比对照显著减轻甚至完全丧失。表明SlAS1基因可能对Cf4/Avr(?)介导的HR起重要调控作用。另外,NbAS(即b48)在本氏烟沉默植株产生的稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)介导产生的过敏性反应症状比对照减轻,而瞬时超表达植株产生的Xoo介导产生的过敏性反应症状比对照则增强。说明AS是植物对Xoo的非寄主抗性的重要调控因子。3番茄和水稻的过量表达和RNAi结构的构建：根据番茄和水稻分别是双子叶和单子叶植物的特性,对番茄AS基因的表达选用35S启动子控制；对水稻AS基因的表达则选用玉米Ubi启动子控制。因此,选用具有卡那霉素抗性植物双元表达载体pCHF3和潮霉素抗性植物双元表达载体pC1301-35S、pCZD、pANDA,构建了适用于番茄的SlAS基因过量表达和RNAi结构pCHF3-SlAS1和pC1301-35S-SlAS1,以及适用于水稻的OsAS基因过量表达和RNAi的结构pCZD-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS(水稻AS基因家族沉默结构)。用电击法将含有AS基因的超表达和RNAi结构分别转入根癌农杆菌EHA105菌株中,阳性转化子用于番茄和水稻的转化。4转基因水稻植株的获得：将含OsAS基因过量表达和RNAi结构的农杆菌与水稻愈伤组织共培养。经潮霉素抗性筛选共获得89个独立的转基因单株,分别获得转过量表达结构pCZD-OsAS1、3、4的再生单株28个、11个和14个；获得转RNAi沉默结构pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS的再生单株7个、12个、14个和2个。T1代苗经潮霉素初步检测大部分为阳性系。5 OsAS基因对水稻农艺性状的影响：大部分转基因植株生长正常,并且超表达植株在长势、植株高度、都优于RNAi植株,家族RNAi植株在这些性状方面又更弱于单基因RNAi植株。