G-CSF动员的外周血单核细胞联合富血小板血浆对POI大鼠治疗效果及机制研究

来源 :广西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cd21love
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背景:粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor G-CSF)动员的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells PBMCs)富含造血干细胞及间充质干细胞(Mesenchymal stem cells MSCs),多项研究均证实MSCs可改善POI的卵巢功能,而富血小板血浆(Platelet-rich plasma PRP)富含VEGF、TGF-β等各类生长因子,有助于组织修复及改善局部微环境。PBMCs及PRP均分别被证实可改善卵巢微环境,可促进卵巢功能的修复,且PRP可提高MSCs的生物学作用和治疗效果。目的:本研究通过环璘酰胺(Cyclophosphamide CTX)构建早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency POI)大鼠模型,探索G-CSF动员后的PBMCs联合PRP对POI大鼠的治疗效果,并从颗粒细胞凋亡及血管新生方面初步分析其可能机制。方法:30只8-10周成年雌性SD大鼠随机分成A组、B组、C组、D组、E组,A组作为正常对照组,为Control组,B、C、D、E组均为POI组。另选择6只5周雄性SD大鼠作为供体制备G-CSF动员后PBMCs和PRP,制备好的PBMCs用流式细胞仪检测CD45-CD90+的细胞数。POI各组经CTX腹腔注射16天构建POI模型,造模结束立即干预治疗,A组(Control组)作为对照组不预处理;B组注射PBS,为POI+PBS组;C组注射PRP,为POI+PRP组;D组注射G-CSF动员后PBMCs组,为POI+PBMCs组;E组注射G-CSF动员后的PBMCs+PRP,为POI+PBMCs+PRP组,各组治疗均采取卵巢核心多点注射。移植后常规记录各组体重变化、阴道涂片动情周期情况,在治疗后5天、10天、20天这3个时间点检测各组的FSH、E2、AMH并行卵巢组织学观察,采用RT-PCR检测POI+PBMCs+PRP组卵巢组织内供体来源雄性特异性Sry基因的表达。TUNEL法检测治疗后10天各组卵巢颗粒细胞凋亡比率,免疫组化检测凋亡相关基因BAX、BCL-2以及CD34、VEGF、AMH、FSHR的表达情况,并采用H-score评分对免疫组化染色结果进行量化分析。结果:(1)G-CSF动员后采集PBMCs的CD45-CD90+细胞数为0.078±0.026%,明显高于未动员组0.0012±0.001%,P<0.001。(2)CTX成功构建POI大鼠模型:CTX造模结束,与Control组相比,POI各组卵巢变小,动情周期出现间情期延长,动情期缩短的紊乱现象,HE染色提示窦前卵泡均明显减少,窦卵泡闭锁,POI各组性激素E2、AMH下降、FSH升高,与Control组相比,P<0.05。(3)G-CSF动员的PBMCs+PRP改善POI大鼠动情周期及性激素:移植治疗后,与Control组相比,POI+PBS组动情周期中的间情期继续延长,动情期持续缩短,POI+PBMCs+PPP组则明显改善;与POI+PBS组相比,POI+PBMCs+PRP组动情期延长,间情期缩短,POI+PRP组及POI+PBMCs组亦有稍改善,但改善程度不明显。治疗后10天,与POI+PBS组相比,POI+PBMCs+PRP组较快恢复AMH升高及FSH下降,P<0.05,E2稍升高;POI+PBMCs组FSH亦有下降,P<0.05,而POI+PRP组FSH水平无明显下降,POI+PBMCs和POI+PRP组的E2、AMH水平亦无明显恢复。治疗20天,POI各组的性激素均不同程度恢复,POI各组之间对比无统计学差异;(4)G-CSF动员的PBMCs+PRP加快恢复POI大鼠窦前卵泡发育:治疗第5天,相比较于POI+PBS组,POI+PBMCs+PRP组及POI+PBMCs组即出现少量窦前卵泡恢复发育;治疗后第10天,POI+PBMCs+PRP组窦前卵泡恢复发育效果更加明显,同时较多出现微血管新生,优于POI+PRP组及POI+PBMCs组,根据治疗10天的卵泡计数统计,Control组与POI+PBMCs+PRP组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡均明显多于POI+PBS组,P<0.05和P<0.01,有统计学意义;治疗后20天,除POI+PBS组外,各组均明显恢复卵泡发育。(5)雄性供体来源的Sry基因在POI+PBMCs+PRP组持续表达:治疗5天,治疗10天,治疗20天POI+PBMCs+PRP组均检测到雄性特异性基因Sry表达。(6)G-CSF动员的PBMCs+PRP减少POI大鼠卵巢颗粒细胞凋亡:TUNEL结果显示POI+PBS组颗粒细胞凋亡比是Control组的两倍多,与POI+PBS组相比,POI+PBMCs+PRP组、POI+PRP组和POI+PBMCs组的颗粒细胞凋亡比率亦明显减少,P<0.05;免疫组化结果及H-score评分显示,Control组抗凋亡基因BCL-2表达最强,促凋亡基因BAX表达最弱,与POI+PBS组相比,POI+PBMCs+PRP组、POI+PBMCs组、POI+PRP组的BCL-2表达上调,BAX表达下调,其中POI+PBMCs+PRP组效果最明显,与Control组结果最相近。(7)G-CSF动员的PBMCs联合PRP移植治疗增强CD34、VEGF、AMH、FSHR在卵巢组织的局部表达:根据免疫组化结果CD34主要表达于卵巢髓质内血管、间质、黄体;VEGF表达集中于间质血管及黄体内;AMH表达以初级卵泡及窦卵泡、黄体等为主;而排卵前卵泡、窦卵泡、黄体均可见FSHR表达,在Control组,CD34、VEGF、AMH、FSHR的表达均最强,相比于其他POI各组,POI+PBMCs+PRP组的表达亦强,效果类似于Control组。根据CD34、VEGF、AMH、FSHR的免疫组化评分,CD34、VEGF、FSHR的H-score评分表现为以下趋势:POI+PBS组
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