背景加味佛手散胶囊是课题组自主研发的抗子宫内膜异位症的中药新药,是由中医妇科经典名方佛手散药物当归、川芎的主要有效成分A、B以及具有止痛作用的C组成的中药单体复方。前期研究表明,该方疗效明显,没有显著毒副作用,已申报国家技术发明专利。有关研究得到国家重大新药创制项目(2014ZX09304-306-04)资助。目的研究“加味佛手散”胶囊制剂工艺,质量标准、稳定性、药代动力学以及对肝脏CYP450酶活性,为创制中药新药“加味佛手散胶囊”提供相应试验资料。方法1.加味佛手散胶囊的制备工艺研究软材过筛制粒法将原料药制备成颗粒后装胶囊。以制粒难易度、颗粒的硬度、均匀度、细粉率、吸湿百分率、流动性、堆密度等为指标,优化填充剂(可溶性淀粉、乳糖、微晶纤维素),主药与填充剂的筛选比例(1：0.2、1：0.5、1：1、1：2),黏合剂(PVP-K30、HPMC、CMC-Na), HPMC的型号(HPMC-K100M、HPMC-K15M、HPMC-K4M), HPMC-K15M的筛选用量(0.2%、0.5%、0.8%、1%)以及助流剂硬脂酸镁的用量,筛选出加味佛手散胶囊的最佳制备工艺。2.加味佛手散胶囊的质量标准研究 建立加味佛手散胶囊的质量标准：①性状：外观、性状和颜色。②鉴别：采用含量测定项下的方法,鉴别受试品溶液HPLC图中各主峰与对照品溶液中的各主峰保留时间是否一致。③检查：按照《中国药典》2010版一部附录Ⅰ制剂通则IE胶囊剂项下检查装量差异、粒度、水分和溶出度。④含量测定：采用HPLC法测定加味佛手散胶囊中的A、B、C的含量。拟定加味佛手散胶囊质量标准(草案)及起草说明。3.加味佛手散胶囊的稳定性研究(1)稳定性影响因素试验：通过60±2℃的高温试验、25℃条件下90%±5%和75%±5%的高湿度试验与4500Lx±500Lx的强光照射试验考察加味佛手散胶囊的稳定性。(2)加速稳定性试验：通过在40℃、75%±5%的湿度下6个月的加速试验考察加味佛手散胶囊的稳定性。(3)长期稳定性试验：通过在25℃±2℃,65%±5%的湿度下9个月的长期试验考察加味佛手散胶囊的稳定性。4.加味佛手散胶囊在大鼠体内的药代动力学研究(1)采用高效液相色谱法分别测定大鼠血浆样品加味佛手散组方中A组分、B组分以及C组分的含量,分别进行方法学验证。(2)将20只SD雌性大鼠随机分为2组,每组10只,按180mg·kg-1剂量灌胃和尾静脉注射加味佛手散原料药,于0、5、10、20、30、60、120、240、480、720 min眼眶取血,检测不同时间点血浆中的药物浓度。利用DAS 3.2.1软件计算药动学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC(0-t)、AUC(0-∞)以及MRT(0-∞),计算出绝对生物利用度。(3)将20只雌性大鼠随机分为2组,每组10只,一组为正常组,另一组为子宫内膜异位症模型组,按180 mg·kg -1的剂量灌胃给予胶囊内容物。灌胃后0、5、10、20、30、60、120、240、480、720 min眼眶取血,检测不同时间点血浆中的药物浓度。采用DAS 3.2.1软件计算药动学参数Cmax、Tmax、t1/2、AUC(0-t)、 AUC(0-∞)以及MRT(0-∞)。5.加味佛手散胶囊对肝微粒体CYP450酶活性的影响研究 (1)对体外人肝微粒体CYP450酶活性的抑制试验：分别设阴性对照组、阳性抑制剂对照组、A成分组、B成分组、C成分组、加味佛手散胶囊组等。应用‘"Cocktail"探针法及LC-MS/MS分析各探针药物代谢产物的浓度,体外评价人肝微粒体CYP1A2、 CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1及CYP3A4亚酶的活性。(2)对体外大鼠肝微粒体CYP450酶活性的抑制试验：试验分组及试验方法同上,体外检测大鼠肝微粒体上述5种亚酶的活性。(3)对体内大鼠肝微粒体CYP450酶活性的诱导试验：将雌性大鼠随机分为阴性对照组,阳性诱导剂对照组、A成分组、B成分组、C成分组、加味佛手散组方组、加味佛手散胶囊45 mg·kg-1·d-1组、90 mg·kg-1·d-1组、180mg·kg-1·d-1组。连续给药28天,每日一次。处死大鼠取其肝脏制备肝微粒体。应用"Cocktail"探针法及LC-MS/MS分析各探针药物及代谢产物的浓度,体内检测大鼠肝微粒体上述5种亚酶的活性。6.加味佛手散胶囊对大鼠肝细胞形态的影响试验：将雌性大鼠随机分为阴性对照组、A成分组、B成分组、C成分组、加味佛手散复方组、加味佛手散胶囊45mg·kg-1·d-1组、90mg·kg-1·d-1组、90 mg·kg-1·d-1组。大鼠连续给药28天,每日一次。处死大鼠取其肝脏。HE染色观察用药前后肝组织病理变化。结果1.加味佛手散胶囊的制备工艺研究结果称取适量A组分、B组分、C组分三药的混合药粉1.8 g,按主药与填充剂的比例1：0.5加入乳糖0.9 g以及黏合剂0.5%HPMC-K15M 0.25 mL制软才,过筛制粒,干燥,再过筛整粒,填入胶囊,密封,铝塑泡罩包装,即得。以此工艺条件制备的三批加味佛手散胶囊色泽一致,颗粒均匀,成型率高,流动性好,吸湿率低。综合评定表明此工艺条件稳定、可行,为胶囊的最佳成型工艺。2.加味佛手散的质量标准研究结果(1)性状：本品为铝塑泡罩包装,胶囊内容物为淡黄色颗粒。(2)鉴别：采用含量测定项下的检测方法分析受试品,其溶液HPLC图中各主峰与对照品溶液HPLC图中各主峰的保留时间一致。(3)检查：本品的粒度、装量差异、水分和溶出度均符合药典要求。(4)含量测定：测定了本品的三个批次含量,胶囊的A组分、B组分、C组分的相对含量均在98%-105%,符合药典规定。以上质量标准研究结果表明,有关指标能够控制加味佛手散胶囊质量。3.加味佛手散胶囊的稳定性研究结果(1)稳定性影响因素试验：在高温、高湿度以及强光照射条件下,本品中A组分、B组分、C组分等3个组成成分与对照品色谱峰保留时间一致,性状、粒径均保持不变,含量略微下降,但仍符合药典规定。(2)加速稳定性试验：6个月试验期间,本品中上述3个组成成分与对照品色谱峰保留时间一致,性状、粒径均保持不变,含量以及溶出度略微下降,但仍符合药典规定。(3)长期稳定性试验：9个月试验期间,本品中上述3种组成成分与对照品色谱峰保留时间一致,性状、粒径均保持不变,含量以及溶出度略微下降,但仍符合药典规定。以上稳定性考察结果表明,在考察期间内,相关质量控制指标基本稳定。4.加味佛手散胶囊在大鼠体内的药代动力学研究结果(1)加味佛手散组方的生物利用度考察：加味佛手散组方中A组分、B组分、C组分在灌胃给药途径的AUC(0～∞)分别为31.77±8.64 mg·h·L-1>97.70±5.26 mg·h·L-1、44.22±10.85mg·h·L-1;在静脉注射给药途径的AUC(0～∞)分别为44.35±17.08 mg·h·L-1,139.65±22.28 mg·h·L-1、61.43±7.76 mg·h·L-1。结果显示：A组分、B组分、C组分的绝对生物利用度分别为71.63%、69.96%、71.98%。说明加味佛手散组方灌胃给药生物利用度高,吸收好,适合制成口服剂型。(2)加味佛手散胶囊在生理和子宫内膜异位症病理模型大鼠的药代动力学比较：子宫内膜异位症病理状态下加味佛手散中A组分的吸收分布与正常大鼠没有显著性差异(P>0.05)；B组分的Tmax较正常大鼠显著缩短(P<0.05),提示在病理状态下B组分进入体内的吸收速度较正常更快；在病理模型中C组分的Cmax、AUC(0-t)和AUC(0-∞)显著高于正常大鼠(P<0.05),表明C组分在病理状态下的吸收程度较正常状态下高。以上结果表明了临床应用加味佛手散胶囊治疗子宫内膜异位疾病的合理性。5.加味佛手散胶囊对肝微粒体CYP450酶活性的影响研究结果(1)对体外人肝微粒体CYP450酶活性的抑制试验：A组分和B组分对5种CYP450的ICso无法求出,提示A组分和B组分对人肝微粒体5种CYP450酶活性无体外抑制作用；C组分对CYP2D6的ICso为9.24μmol·L-1,小于10μmol·L-1,大于1μmol·L-1,提示C组分对人肝微粒体CYP2D6的酶活性有较强的体外抑制作用；加味佛手散胶囊组对CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的ICso分别为123.9 mg·L-1、189.9 mg·L-1、171.3 mg·L-1,远远小于最高浓度的一半1600 mg·L-1,提示加味佛手散胶囊对人肝微粒体CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的酶活性具有体外抑制作用。(2)对体外大鼠肝微粒体CYP450酶活性的抑制试验：A组分和B组分对5种CYP450的ICso无法求出,提示A组分和B组分对大鼠肝微粒体5种CYP450酶活性体外无抑制作用；C组分对CYP3A4的IC50为7.46μmol·L-1,小于10 μmol·L-1,大于1 μmol·L-1，提示C组分对大鼠肝微粒体CYP3A4的酶活性有较强的体外抑制作用；加味佛手散胶囊组对CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的ICso分别为241.3 mg·L-1、369.8 mg·L-1、293.0 mg·L-1,远远小于最高浓度的一半1600 mg·L-1,提示加味佛手散胶囊对大鼠肝微粒体CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4的酶活性具有体外抑制作用。(3)对大鼠体内肝微粒体CYP450酶活性的诱导试验：与阴性对照组比较,A、B、C 3个单体成分组5种CYP450亚型的酶活性均无显著性差异(P>0.05),加味佛手散胶囊180 mg·kg-1·d-1组和加味佛手散复方(A+B+C)组CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的酶活性显著升高(P<0.05),提示A、B、C 3个单体成分对大鼠肝微粒体5种CYP450的酶活性均无诱导作用,加味佛手散胶囊对大鼠肝脏的CYP1A2、 CYP2C9、CYP3A4的酶活性具有诱导作用。6.加味佛手散胶囊对大鼠肝细胞形态的影响试验结果：用药后A组分和B组分组肝细胞形态正常,C组分组肝小叶界限不清,肝细胞排列紊乱,边缘模糊,细胞核大小不均,炎细胞浸润。加味佛手散组方组、加味佛手散胶囊组有炎细胞浸润,但病理变化程度明显较C组分组轻微。显示加味佛手散胶囊全方能减少C组分单独使用对肝脏细胞形态的损伤。结论1.研究获得了抗子宫内膜异位症的中药新药制剂加味佛手散胶囊的制备工艺,该工艺操作简单,质量控制标准能够达到质量控制目的,稳定性良好。2.生物利用度研究显示加味佛手散组方灌胃给药生物利用度高,适合制成口服剂型。加味佛手散胶囊中B组分的吸收速度和C组分的吸收程度在子宫内膜异位症病理模型大鼠体内均显著优于正常大鼠,显示了加味佛手散胶囊治疗子宫内膜异位症药代动力学的合理性。3.加味佛手散胶囊体内试验能显著诱导大鼠肝脏CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4的酶活性；体外试验对人和大鼠肝微粒体CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4活性均有显著的抑制作用。提示加味佛手散胶囊如果与其他经CYP1A2、CYP2C9酶代谢的药物同时使用,可能使该药作用效果降低,作用时间缩短,联合用药时应适当增加用药剂量；如果与其他经CYP2D6、CYP2E1酶代谢的药物同时使用,可能使该药作用效果增强,作用时间延长,联合用药时应适当减少用药剂量。4.加味佛手散胶囊体内试验能减少C组分单独使用对肝脏细胞形态的损伤,结合体内诱导试验显示加味佛手散胶囊复方加快C组分单用在肝脏的代谢,提示该制剂处方组成的合理性。