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豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)隶属于半翅目(Hemiptera)，蚜科(Aphididae)，是一种重要的农业害虫。无翅型是蚜虫无性世代较为常见的表型，以寄主植物为庇护所的无翅蚜在遭遇天敌威胁时表现出自发性掉落行为，掉落之后采取不同的觅食策略探寻寄主植物。觅食策略的多样性可降低种群灭绝的风险。已有文献报道，无翅型豌豆蚜从寄主植物上掉落后常采用两种觅食策略，一种采用“Runners”觅食策略，表现为行走速度快，行走过程中转向率低，路径较直，朝远离原寄主植物方向探寻新的寄主；另一种为“Searchers”觅食策略，表现为行走速度慢，行走过程中随机转向率高，路径多盘曲，倾向于返回到原寄主植物上或探寻邻近的寄主植物。已有文献报道PKG与PKA均参与调控昆虫觅食行为，但豌豆蚜觅食行为是否受这2种基因调控，还未见报道。本研究利用候选基因法，探究PKG及PKA对无翅型豌豆蚜觅食策略的影响，为豌豆蚜觅食策略分子机制的研究提供理论基础，同时，可为蚜虫的生物防治提供参考数据。
本研究以无翅豌豆蚜为研究对象。为获得“Runners”型和“Searchers”型蚜虫，依据前人的研究建立了鉴定豌豆蚜觅食策略的方法。运用RT-qPCR技术和酶活性测定技术，测定了“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部PKG与PKA的表达水平及这2种激酶的酶活性，进而运用RNA干扰技术和药理学手段对候选基因进行了功能验证。
1.PKG与PKA在“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部的mRNA水平表达模式。运用RT-qPCR技术，分别测定了PKG基因4个转录本(PKGtvX1、PKGtvX2、PKGtvX3和PKGtvX4)、1个PKA催化亚基(PKA catalyktic subunit，PKAc)和2个PKA调节亚基(PKA regulatory subunit，PKA r)在“Runners”和“Searchers”成蚜头部mRNA水平的表达量，结果发现“Runners”头部PKG的4个转录本的表达量均高于“Searchers”。其中，PKGtvX1在“Runners”成虫头部表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)，PKGtvX3与PKGtvX4在“Runners”成虫头部表达量显著高于“Searchers”(P＜0.05)，PKGtvX2在“Runners”成虫头部mRNA表达量高于“Searchers”但不显著(P＞0.05)；PKAc与PKAr1在“Runners”成虫头部表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)，PKAr2在“Runners”成虫头部mRNA表达量显著高于“Searchers”(P＜0.05)。此外，还测定了PKG4个转录本mRNA水平的总体表达情况，结果表明“Runners”成虫头部PKGmRNA表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)。酶活性测定结果显示，“Runners”头部的PKG激酶与PKA激酶酶活性均显著性高于“Searchers”(P＜0.05)。
2.PKG与PKA在“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部的蛋白水平表达模式。运用WesternBlot技术，以β-Tubulin为内参蛋白，检测两种觅食策略豌豆蚜头部PKG和PKA蛋白水平的表达量，结果未得到目的蛋白的特异性条带，内参蛋白β-Tubulin条带大小约为55KD。
3.采用RNAi技术对PKG与PKA基因功能进行验证。根据PKG4个转录本的共有序列设计豌豆蚜PKG干扰片段。此外，分别设计PKAc和PKAr1的干扰序列。将合成的PKG-dsRNA、PKAc-dsRNA和PKAr1-dsRNA分别对4龄第1天蚜虫进行注射，注射浓度为5μg/μL，每头注射150nL，48h后(5龄第1天)，测定蚜虫头部候选基因mRNA表达量的变化。结果表明，注射PKG-dsRNA与PKAc-dsRNA的表达量显著高于未注射的“Runners”空白对照组、注射生理盐水的“Runners”空白对照组和注射GFP-dsRNA的阴性对照组(P＜0.05)；注射PKAr1-dsRNA的表达量显著低于未注射的“Runners”空白对照组(P＜0.05)，但却显著高于注射生理盐水的“Runners”空白对照组和注射GFP-dsRNA的阴性对照组(P＜0.05)。实验结果表明2个侯选基因沉默效果均不理想，故无法从mRNA水平上验证候选基因对豌豆蚜觅食策略的影响。
4.运用药理学手段，对“Searchers”型豌豆蚜进行激动剂处理。实验设实验组和空白对照组。注射8-Br-cGMP(PKG激动剂)和8-Br-cAMP(PKA激动剂)的“Searchers”为实验组，注射0.65%生理盐水的为8-Br-cGMP“Searchers”的空白对照组，注射4%DMSO(0.65%生理盐水稀释)为注射8-Br-cAMP“Searchers”的空白对照组，未做激动剂处理的“Runners”和“Searchers”为未注射空白对照组。对5龄第1天蚜虫进行注射，注射浓度为100μM，每头注射100nL，4h后进行酶活性检验及行为测定分析。结果表明8-Br-cGMP可以使PKG激酶活性显著升高(P＜0.05)，但未对PKA激酶的酶活性产显著性影响(P＞0.05)，行为测定结果显示注射8-Br-cGMP的“Searchers”觅食行为更趋近于“Runners”；8-Br-cAMP显著提高PKA酶活性(P＜0.05)，但未对PKG激酶酶活性产生显著性影响(P＞0.05)，行为测定结果显示注射8-Br-cAMP的“Searchers”的觅食行为与未处理的“Searchers”无显著差异(P＞0.05)。由此，可以推测PKG激酶对无翅型豌豆蚜觅食行为起一定调控作用。
本研究以无翅豌豆蚜为研究对象。为获得“Runners”型和“Searchers”型蚜虫，依据前人的研究建立了鉴定豌豆蚜觅食策略的方法。运用RT-qPCR技术和酶活性测定技术，测定了“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部PKG与PKA的表达水平及这2种激酶的酶活性，进而运用RNA干扰技术和药理学手段对候选基因进行了功能验证。
1.PKG与PKA在“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部的mRNA水平表达模式。运用RT-qPCR技术，分别测定了PKG基因4个转录本(PKGtvX1、PKGtvX2、PKGtvX3和PKGtvX4)、1个PKA催化亚基(PKA catalyktic subunit，PKAc)和2个PKA调节亚基(PKA regulatory subunit，PKA r)在“Runners”和“Searchers”成蚜头部mRNA水平的表达量，结果发现“Runners”头部PKG的4个转录本的表达量均高于“Searchers”。其中，PKGtvX1在“Runners”成虫头部表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)，PKGtvX3与PKGtvX4在“Runners”成虫头部表达量显著高于“Searchers”(P＜0.05)，PKGtvX2在“Runners”成虫头部mRNA表达量高于“Searchers”但不显著(P＞0.05)；PKAc与PKAr1在“Runners”成虫头部表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)，PKAr2在“Runners”成虫头部mRNA表达量显著高于“Searchers”(P＜0.05)。此外，还测定了PKG4个转录本mRNA水平的总体表达情况，结果表明“Runners”成虫头部PKGmRNA表达量极显著高于“Searchers”(P＜0.01)。酶活性测定结果显示，“Runners”头部的PKG激酶与PKA激酶酶活性均显著性高于“Searchers”(P＜0.05)。
2.PKG与PKA在“Runners”和“Searchers”豌豆蚜成虫头部的蛋白水平表达模式。运用WesternBlot技术，以β-Tubulin为内参蛋白，检测两种觅食策略豌豆蚜头部PKG和PKA蛋白水平的表达量，结果未得到目的蛋白的特异性条带，内参蛋白β-Tubulin条带大小约为55KD。
3.采用RNAi技术对PKG与PKA基因功能进行验证。根据PKG4个转录本的共有序列设计豌豆蚜PKG干扰片段。此外，分别设计PKAc和PKAr1的干扰序列。将合成的PKG-dsRNA、PKAc-dsRNA和PKAr1-dsRNA分别对4龄第1天蚜虫进行注射，注射浓度为5μg/μL，每头注射150nL，48h后(5龄第1天)，测定蚜虫头部候选基因mRNA表达量的变化。结果表明，注射PKG-dsRNA与PKAc-dsRNA的表达量显著高于未注射的“Runners”空白对照组、注射生理盐水的“Runners”空白对照组和注射GFP-dsRNA的阴性对照组(P＜0.05)；注射PKAr1-dsRNA的表达量显著低于未注射的“Runners”空白对照组(P＜0.05)，但却显著高于注射生理盐水的“Runners”空白对照组和注射GFP-dsRNA的阴性对照组(P＜0.05)。实验结果表明2个侯选基因沉默效果均不理想，故无法从mRNA水平上验证候选基因对豌豆蚜觅食策略的影响。
4.运用药理学手段，对“Searchers”型豌豆蚜进行激动剂处理。实验设实验组和空白对照组。注射8-Br-cGMP(PKG激动剂)和8-Br-cAMP(PKA激动剂)的“Searchers”为实验组，注射0.65%生理盐水的为8-Br-cGMP“Searchers”的空白对照组，注射4%DMSO(0.65%生理盐水稀释)为注射8-Br-cAMP“Searchers”的空白对照组，未做激动剂处理的“Runners”和“Searchers”为未注射空白对照组。对5龄第1天蚜虫进行注射，注射浓度为100μM，每头注射100nL，4h后进行酶活性检验及行为测定分析。结果表明8-Br-cGMP可以使PKG激酶活性显著升高(P＜0.05)，但未对PKA激酶的酶活性产显著性影响(P＞0.05)，行为测定结果显示注射8-Br-cGMP的“Searchers”觅食行为更趋近于“Runners”；8-Br-cAMP显著提高PKA酶活性(P＜0.05)，但未对PKG激酶酶活性产生显著性影响(P＞0.05)，行为测定结果显示注射8-Br-cAMP的“Searchers”的觅食行为与未处理的“Searchers”无显著差异(P＞0.05)。由此，可以推测PKG激酶对无翅型豌豆蚜觅食行为起一定调控作用。