蛇床子(Fructus Cnidii),英文名为Common Cnidium Fruit,别名野胡萝卜子、蛇米、野茴香,为伞形科植物Cnidium monnieri(L.)Cusson的果实,是《中国药典》2010年版收载的常用中药。该药材在中国大部分地区均有分布。临床常用于治疗阳痿宫冷、寒湿带下、湿痹腰痛、外阴湿疹、妇人阴痒、滴虫性阴道炎等多种疾病。研究表明,蛇床子主要含有香豆素类化合物,此外还含有黄酮类、挥发油类、糖类、以及有机酸类化合物。目前的化学成分研究和药理学研究揭示香豆素类和黄酮类成分是影响其药理学活性的主要活性成分。迄今为止,有关蛇床子中多种化学成分的同时测定、药物代谢和药代动力学研究方面的文献较少。本研究首先建立了同时测定蛇床子中16种活性成分的LC-ESI-MS/MS分析方法,该方法可用于蛇床子药材的全面质量控制,提高了蛇床子药材的质量控制水平;在本研究中,还建立了灵敏度高,专属性强的UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆样品中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种香豆素类活性成分,并将该方法应用于大鼠灌胃给予蛇床子提取物后血浆中6种成分的药代动力学研究,为中药材蛇床子的临床应用提供参考依据;还建立了同时测定八子补肾胶囊中14种活性成分的UPLC-ESI-MS/MS定量分析方法,并应用于八子补肾胶囊的质量控制;建立了同时测定蛇床子中7种香豆素类活性成分的GC-MS-SIM定量分析方法,为中药材蛇床子的质量控制提供新的分析手段;采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技术,对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行了鉴定研究,推测出佛手柑内酯在大鼠体内的代谢规律和主要代谢途径,为佛手柑内酯的临床应用提供重要参考。第一部分HPLC-ESI-MS/MS法同时测定蛇床子中16种活性成分的含量及其质量表征目的:建立一种快速、准确的LC-ESI-MS/MS定量分析方法,可同时分离、测定不同来源的蛇床子药材中16种活性成分(9种香豆素类,包括蛇床子素、花椒毒酚、异补骨脂素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、花椒毒素、二氢欧山芹素、欧前胡素和异欧前胡素;7种黄酮类,包括山奈酚、异鼠李素、槲皮苷、木犀草素、槲皮素、橙皮苷和芦丁),并用于12批不同来源蛇床子药材的质量分析。方法:液相色谱柱Waters XBridge C18柱(250×4.6 mm,5μm);流动相为A:乙腈,B:水(含有0.1%乙酸),梯度洗脱,分析时间为15 min,流速为1.0 m L/min。质谱采用电喷雾离子源(ESI源),Turbo V离子源,源温度(TEM)550℃,采用多反应离子监测(MRM),进行正负离子同时检测。源喷射电压(IS)为4500 V和-4500 V,雾化温度为650℃,雾化气(GS1,N2)为50 psi,辅助气(GS2,N2)为60 psi,气帘气(N2)为25 psi。接口持续加热,全程氮气通入状态。每个离子对的滞留时间为40 ms。DP为10/-10 V;CXP为5/-5 V。全扫描相对分子量范围为100~1000。结果:16种活性成分的线性关系良好(r2≥0.9987),检测限和定量限分别为1.71~7.29 ng/m L和5.10~20.01 ng/m L。日内日间精密度分别为0.5~3.6%和0.6~3.5%。稳定性和重复性的相对标准偏差分别为0.5~3.9%和0.5~3.2%。平均回收率范围在96.89%~101.6%。结论:本研究首次建立了HPLC-ESI-MS/MS法,采用在一个分析周期内正负离子多次切换的检测模式,同时定性和定量分析蛇床子药材中16种有效成分,并将该方法应用于12批不同来源药材的质量分析,该方法操作简便、快速、灵敏度高、专属性强,可为蛇床子药材的质量控制提供参考依据。从样品的含量测定结果来看,各产地之间12批次蛇床子药材的质量差异大,提示药材质量受产地及其种植地天气状况等的影响。因而有必要对药材的产地及采集等进行跟踪检测,以保证蛇床子药材质量和药效的稳定。第二部分UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠口服蛇床子提取物后血浆中6种成分及药代动力学研究目的:建立一种同时测定大鼠血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种香豆素类化合物含量的UPLC-ESI-MS/MS方法,成功的应用于大鼠灌胃给予蛇床子提取物后血浆中6种成分的药代动力学研究,并建立其药-时曲线,阐明药动学参数与特征。方法:大鼠灌胃给与蛇床子提取物(6 m L/kg)后,分别于给药后0.08,0.17,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,9,12,18,24和30 h眼内眦静脉丛取血0.3 m L,制备血浆样品,采用甲醇直接沉淀蛋白法进行样品预处理,磺胺甲噁唑为内标。Waters ACQUITY BEH C18柱(50mm×2.1mm,1.7mm),流动相为A(乙腈)-B(0.1%乙酸),梯度洗脱,洗脱程序如下:0.0-1.3 min,30%-50%A;1.3-2.2 min,50%-80%A;2.2-3.5 min,80%A等度洗脱;3.5-4.0 min,80%-30%A;4.0-5.0 min,30%A等度洗脱。进样前预平衡1 min。流速为0.3 m L/min。色谱柱后溶液全部进入离子源,无分流,分析时间5 min,进样量2μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),Step Wave?离子源,源温度(Source Temp)为150℃,毛细管(Capillary)电压为2.0 k V,离子源补偿电压(Source Offset)为50 V,脱溶剂气温度(Desolvation Temp)为500℃,脱溶剂气(Desolvation)流量为800 L/Hr,锥孔气(Cone)流量为150 L/Hr,雾化气(Nebuliser)压力为7.0 Bar,接口处加热,采用多反应监测模式(MRM)。6种被测成分和内标物的监测离子对分别为:花椒毒素m/z 216.97/201.95、异茴芹内酯m/z246.97/231.91、佛手柑内酯m/z 216.97/201.96、欧前胡素m/z271.03/202.95、蛇床子素m/z 244.97/188.97、异欧前胡素m/z270.97/202.96和磺胺甲噁唑m/z 254.12/156.08。结果:血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素分别在0.20~100.16、0.20~99.61、0.20~100.22、0.20~98.03、0.20~99.50和0.20~100.13 ng/m L范围内线性关系良好(r2≥0.9983),最低定量限(LLOQ)≤0.21 ng/m L。日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于6.2%,相对误差(RE)为-7.5%~5.1%。平均提取回收率为72.3%~88.7%。大鼠口服灌胃给予蛇床子提取物后,血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种待测成分在大鼠体内的药代动力学药-时曲线有所差异,其中,欧前胡素吸收最快,达峰时间为给药后1 h;异欧前胡素在给药后1.5 h达到最高血药浓度;花椒毒素达峰时间为给药后2 h左右;异茴芹内酯和佛手柑内酯吸收稍慢,达峰时间为给药后3 h;蛇床子素吸收最慢,于给药后6 h达到血浆峰浓度。总体来说,大鼠灌胃给予蛇床子提取物后,6种待测成分在体内吸收均较迅速,5 min均可检测到,并且具有相近的消除速率。结论:本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素的含量,并应用于蛇床子中6种活性成分在大鼠体内的药代动力学研究。该方法操作简单、快速、专属性强、灵敏度高,对蛇床子药材的体内定量分析具有重要意义,有益于传统中药蛇床子的临床应用。第三部分UPLC-ESI-MS/MS法测定八子补肾胶囊中14种成分含量目的:建立UPLC-ESI-MS/MS法测定八子补肾胶囊中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金丝桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和熊果酸等14种成分的含量。方法:取八子补肾胶囊20粒,倾出内容物,研细,混匀,取粉末约4.00 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入70%乙醇80 m L,精密称定,超声(功率:100W;频率:25 k Hz)处理60 min,放冷,再精密称定,用70%乙醇补充损失的重量,摇匀,离心,用0.2μm滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液,负离子模式直接进样2μL,正离子模式稀释40倍后进样2μL。色谱质谱条件:Waters ACQUITY BEH C18柱(50mm×2.1mm,1.7mm),流动相为A(乙腈)-B(0.1%乙酸),梯度洗脱,洗脱程序如下:0.0-1.3 min,30%-50%A;1.3-2.2 min,50%-80%A;2.2-3.5 min,80%A等度洗脱;3.5-4.0min,80%-30%A;4.0-5.0 min,30%A等度洗脱。进样前预平衡1 min。流速为0.3 m L/min。色谱柱后溶液全部进入离子源,无分流,分析时间5min,进样量2μL。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),Step Wave?离子源,源温度(Source Temp)为150℃,毛细管(Capillary)电压为2.0 k V,离子源补偿电压(Source Offset)为50 V,脱溶剂气温度(Desolvation Temp)为500℃,脱溶剂气(Desolvation)流量为800 L/Hr,锥孔气(Cone)流量为150 L/Hr,雾化气(Nebuliser)压力为7.0 Bar,接口处加热,采用多反应监测模式(MRM)。花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素、五味子甲素、五味子醇甲等8种组分采用正离子模式检测,金丝桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和熊果酸等6种组分采用负离子模式检测。结果:在5min内八子补肾胶囊中14种主要成分实现良好分离,峰面积与浓度呈良好的线性关系(r2≥0.9989);花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金丝桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和熊果酸加样回收率分别为99.56%,99.47%,99.69%,101.2%,99.89%,100.2%,99.86%,101.2%,98.69%,101.1%,98.65%,99.75%,101.9%和97.89%(n=3)。RSD值分别为1.1%,0.9%,1.3%,1.1%,1.5%,1.4%,1.4%,0.8%,1.7%,1.7%,1.9%,1.5%,1.6%和2.1%。结论:该方法操作简便、准确、灵敏度高、重现性好,专属性强,可用于八子补肾胶囊的质量控制。第四部分GC-MS-SIM法同时测定蛇床子中7种香豆素类活性成分的含量目的:建立一种快速、准确的GC-MS-SIM定量分析方法,同时分离、测定不同来源的蛇床子药材中异补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、蛇床子素、异茴芹内酯、欧前胡素和二氢欧山芹醇等7种香豆素类活性成分的含量,并应用于12批不同来源蛇床子药材的质量分析。方法:色谱柱为DB-1毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm);柱温采用程序升温:50℃保持2 min,以20℃/min升至250℃,保持10 min,再以10℃/min升至280℃,保持10 min;进样口温度250℃;分流比:40:1;载气(He)流速1.54 m L/min。接口温度280℃;离子源温度250℃;溶剂切割时间:4 min;四极杆温度150℃;采用电子轰击离子化(EI源)电离方式:电子能量70 e V;扫描方式:选择离子检测模式(SIM);扫描范围:50~350 amu。结果:7种香豆素类活性成分的线性关系良好(r2≥0.9986),检测限和定量限分别为1.06~10.11 ng/m L和3.21~29.88 ng/m L。日内日间精密度分别为0.7~2.5%和1.2~3.3%。稳定性和重复性的相对标准偏差分别为0.5~2.5%和0.8~3.0%。平均回收率范围为92.38%~100.53%。结论:本研究首次建立了GC-MS-SIM法,同时定性和定量分析蛇床子药材中7种香豆素类有效成分,并将该方法应用于12批不同来源药材的质量分析,该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可为蛇床子药材的质量控制提供参考依据。从样品的含量测定结果来看,各产地之间12批次蛇床子药材的质量差异大,提示药材质量受产地及其种植地天气状况等的影响。因而有必要对药材的产地及采集等进行跟踪检测,以保证蛇床子药材质量和药效的稳定。第五部分UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析佛手柑内酯在大鼠体内的代谢目的:建立一种UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法,对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行鉴定研究,推测佛手柑内酯在体内的代谢规律和主要代谢途径。方法:大鼠灌胃给予佛手柑内酯,收集给药前后的尿液和胆汁,采用Waters Ostro 96孔板法处理样品。色谱柱为Waters HSS T3 C18柱(100mm×2.1mm,1.8mm);柱温为40℃;流动相为A(含0.1%甲酸的水溶液)-B(含0.1%甲酸的乙腈溶液),采用梯度洗脱方式;流速为0.5m L/min;进样量2μL。数据采集方式为ESI(+)MSE模式;毛细管电压2.5k V;电离源温度120℃,锥孔电压为60 V,数据采集质量范围为50~1200Da;去溶剂化温度:500℃;脱溶剂气体流速:800L/min;锥空气体流速:50L/min。结果:尿液和胆汁中共发现佛手柑内酯大鼠体内可能的代谢产物17个,其中尿液中有17个,胆汁中有16个,胆汁中的16个代谢产物在尿液中均被发现。佛手柑内酯在胆汁和尿液中的Ⅰ相代谢产物有6个,主要为双键氧化,氧化脱甲基,水解等;Ⅱ相代谢产物有11个,主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。佛手柑内酯在尿液和胆汁中的代谢物种类并无明显差异,只是代谢物的含量不同。结论:本研究首次建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS法,对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行鉴定研究,推测出佛手柑内酯在体内的代谢规律和主要代谢途径。该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于体内微量成分的分析鉴定。