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目的
1．分析儿童肺炎链球菌对各类抗生素的耐药状况及特点，以便指导临床合理使用抗菌药物，防止耐药菌株的传播和控制院内感染。
2．分析青霉素pbp2B基因的突变情况及与青霉素耐药表型之间的关系。
3．调查红霉素相关耐药基因e硼B和mefA的流行状况，分析其与红霉素耐药的关系。
4．调查四环素相关耐药基因tetM的流行状况，分析其与四环素耐药的关系。
方法
1．对从温州医学院附属第二／育英儿童医院2004年12月一2006年1月住院儿童的呼吸道、血液、脑脊液、脓液和胸水标本中分离到的70株肺炎链球菌(P1一P70)进行10种抗生素敏感性试验，其中对青霉素进行8个药物浓度检测。
2．用PCR法检测肺炎链球菌青霉素耐药相关基因曲p2B，并对pbp2B进行基因测序。共检测30株肺炎链球菌，青霉素敏感4株，中介5株，耐药21株。
3．对P1一P43共43株肺炎链球菌进行红霉素相关耐药基因ermB和me似的检测。其中红霉素耐药40株，红霉素敏感3株。
4．对P1一P43共43株肺炎链球菌进行四环素相关耐药基因tetM的检测。其中四环素耐药38株，四环素敏感5株。
结果
1．70株肺炎链球菌中，万古霉素未检出耐药菌株，敏感率为1.00‰左旋氧氟沙星对肺炎链球菌也显示了很好的抗菌活性，敏感率为98．6％。青霉素、红霉素、克林霉素、四环素和复方新诺明对肺炎链球菌的敏感性均很低，在15％以下。敏感率在90％以下的抗生素从高到低依次为：氯霉素70％、头孢噻肟50％、喹奴普汀一达福普汀37．1％、青霉素14．3％、克林霉素10％、四环素10％、红霉素4．3％、复方新诺明2．9％。青霉素、头孢噻肟和复方新诺明的中介率分别为50％、25．7％和21．4％。
2．70株肺炎链球菌对青霉素的不敏感率达85．7％(60／70)，其中中介50％(35／70)，耐药35．7％(25／70)。MIC值≥O．5μg/ml的菌株占了总数的78．6％(55／70)，MIC值≥4μg／ml的菌株占了总数的12．9％(9／70)。
3．取pbp2B基因高度变异区的第1003核苷酸一第1602核苷酸片段与SpR6株的pbp2B进行比对。与SpR6株比较，4株青霉素敏感株有99．3％以上的核苷酸相同，没有发生氨基酸的替换。26株青霉素不敏感株均为突变株，与SpR6株相比核苷酸改变最多的达13．9％，氨基酸改变最多的达7．5％。不同菌株的氨基酸序列替换不尽相同。突变位点最集中在Ser417一Thr494之间的片段，共有¨个氨基酸替换，包括Ser417一Pro、Asn427一Tyr、Thr431一Lys、Gln432一Leu、Gln443一Glu、Thr451一A1a、Leu460一I1e、Ser478一Thr、Glu481一G1y、Ser485一Ala、Thr494一Ala，这些氨基酸的改变在所有青霉素不敏感的肺炎链球菌中均有发生。根据pbp2B基因序列的分析，26株青霉素不敏感肺炎链球菌中的24株可分为I—V组。除I组外，II—V组在Ser417一卟r494片段之外均存在其他的氨基酸改变，其中Glu338一Gly为II—V组所共有，总计有84．6％的菌株(22／26)在此处发生氨基酸改变。所有青霉素mC值≥4μg／ml的菌株在Ser417一Thr494片段之外均存在氨基酸改变。
4．红霉素ermB基因总检出率为76．7％(33／43)，mefA基因总检出率为23．3％(10／43)。3株红霉素敏感的肺炎链球菌均未检出ermB基因和mefA基因；40株红霉素耐药肺炎链球菌ermB基因和mefA基因的PCR检出率分别为82．5％(33／40)和25％(10／40)。共有35株肺炎链球菌检出ermB基因或／和mefA基因，耐药基因的总检出率为81．4％。其中单独携带ermB基因的耐药表型为25株，占71．4％(25／35)；单独携带mefA基因的耐药表型2株，占5．7％(2／35)；同时携带ermB基因和mefA基因的耐药表型8株，占22．9％(8／35)。
5．43株肺炎链球菌tetM基因的检出率为87％，其中四环素耐药组的检出率是94．7％，敏感组为25％。
结论
1．肺炎链球菌临床检出株对大多数常用抗生素的耐药性强，多重耐药菌比例很高。肺炎链球菌对万古霉素和左旋氧氟沙星最为敏感，其次是氯霉素；青霉素不敏感的肺炎链球菌比率很高；克林霉素、四环素、红霉素和复方新诺明已不是治疗肺炎链球菌的有效药物。
2．pbp2B基因突变中，Ser417一Thr494片段的氨基酸改变可能仅仅导致青霉素的低浓度耐药(MIC≤2μg/m1)，而G1u338一Gly、Gly347一Arg、ne366一Leu、Lys37l—Asn、Glu374一Asp、Ala521一Ser中一个或多个位点的氨基酸替换可能是导致肺炎链球菌对青霉素高度耐药(MIC≥4μg／m1)的重要因素。84．6％的菌株发生氨基酸G1u338一Gly的替换，提示G1u338一G1y可能是青霉素敏感性下降的一个重要的氨基酸替换。
3．ermB基因和mefA基因同时表达或单独表达均可导致红霉素耐药，ermB基因表达是儿童肺炎链球菌对红霉素耐药的主要原因，mefA基因表达是造成对红霉素耐药的次要原因。红霉素已不是治疗肺炎链球菌的有效药物。
4．tetM基因是造成儿童肺炎链球菌四环素耐药的主要原因，四环素已不是治疗肺炎链球菌的有效药物。肺炎链球菌四环素耐药尚存在其他的耐药机制。