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肾癌相关抗原G250／MN／CAⅨ的基因克隆、表达及相关研究 研究目的： 1．进一步验证G250／MN／CA Ⅸ在肾癌组织中的特异性表达，阐明其作为肿瘤标记物的潜力。 2．克隆G250／MN／CA Ⅸ全长cDNA，构建原核表达载体，并进行蛋白表达、鉴定和G250／MN／CA Ⅸ蛋白免疫原性的研究。 材料与方法： 1．25例肾癌和21例正常肾组织为研究对象，提取总RNA，两步法进行RT-PCR反应，用G250／MN／CAⅨ的特异性引物扩增200bp片段，2％琼脂糖凝胶电泳后观察结果，PCR产物回收、纯化后与pMD18-T载体连接，转化JM109宿主菌，筛选阳性克隆测序。 2．提取肾癌组织总RNA，利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增G250／MN／CA Ⅸ全长cDNA，将获得的cDNA片段定向插入pET-22b(+)表达载体，经过鉴定、筛选后，转化BL-21(DE3)大肠杆菌中，以IPTG诱导进行表达。通过SDS-PAGE电泳观查结果并电转移硝酸纤维素膜，用肾癌病人血清做western blot检测，正常人血清为对照。 结果 1．25例肾癌组织标本中有22例(88％)扩增出200bp目的片段，而正常肾组织的RT-PCR产物均无相应的G250／MN／CA Ⅸ条带，两者之间有显著性差异(P＜0.001)；而且17例透明细胞癌标本中全部扩增出目的片段。经过测序证实扩增产物与GenBank中公布的相应序列一致。 2．通过RT-PCR扩增出了特异性条带，PCR结果经过测序表明与Genoank中公布的G250/MN/CAIX编码区完全一致;构件的重组质粒pET一22b(+)/G250双酶切产物琼脂糖凝胶电泳所得条带位置正确;pET一22b(+)/G25O在BL一21(DE3)中表达产物的SDS一PAGE电泳结果在相应位置出现特异性条带;western blot检测显示2例肾癌患者血清均在相应位置出现阳性反应，而正常人血清为阴性反应。 结论 1.G250/MN/以以在多数肾癌组织中有表达，而在正常肾组织中无表达，有作为肾癌的肿瘤标记物的潜力。 2.本实验克隆获得了G25O/MN/CAIX基因的全长cDNA片段，成功构建重组质粒pET一22b(+)/能50，并在大肠杆菌BL一21(DE3)中表达出该蛋白，免疫印记实验证实该重组蛋白可以被肾癌患者血清特异性识别。这为G250/MN/CAIX在肾癌的基础理论和临床应用等相关方面的研究奠定了基础。